新型體外診斷用蛋白質(zhì)芯片基底材料以及表面化學(xué)策略.pdf

1、生物芯片技術(shù)發(fā)源自20世紀(jì)90年代初，它利用先進(jìn)的微型化技術(shù)，將數(shù)以萬計(jì)的生物樣品與復(fù)雜的功能結(jié)構(gòu)集成在一塊幾平方厘米的芯片上，實(shí)現(xiàn)高集中，高通量，高精度的快速檢測與分析。利用DNA芯片的生產(chǎn)技術(shù)，將數(shù)百到數(shù)干種蛋白點(diǎn)制在芯片上面，然后分析生物樣品中的蛋白質(zhì)，被結(jié)合的蛋白質(zhì)可以通過后續(xù)的手段進(jìn)行分析，如熒光成像、時(shí)間飛行質(zhì)譜分析、肽質(zhì)量指紋分析等。這種新型的蛋白質(zhì)分析方法可以取代傳統(tǒng)的蛋白印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法，可以快速的、高通量的研究

2、疾病相關(guān)蛋白或蛋白質(zhì)之間的相互作用。雖然這種蛋白質(zhì)芯片技術(shù)與基因芯片技術(shù)相似，有顯著的優(yōu)越性，尤其是只需要微量的珍貴的蛋白質(zhì)樣品，被檢測的生物樣品的用量也很少，但現(xiàn)實(shí)中，這種技術(shù)的應(yīng)用受到很多的限制。制作蛋白質(zhì)芯片遠(yuǎn)遠(yuǎn)要比制作基因芯片來的復(fù)雜和困難。與已經(jīng)成熟的DNA芯片相比，蛋白質(zhì)芯片有著自己的特殊性：1、蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)及空間結(jié)構(gòu)均十分復(fù)雜，受環(huán)境影響容易變性；2、蛋白質(zhì)來源有限，不能大量人工合成；3、蛋白芯片的基礎(chǔ)是抗原抗體親和反

3、應(yīng)，特異性及親和力有限，尤其當(dāng)固定在表面時(shí)。4、不同的蛋白質(zhì)在臨床樣品中的豐度不同，抗體抗原反應(yīng)的親和力不同；5、蛋白質(zhì)之間存在著交叉反應(yīng)。
　　 在臨床診斷中，基于酶聯(lián)免疫吸附分析原理的低密度的蛋白質(zhì)芯片最具有應(yīng)用的價(jià)值，已經(jīng)逐漸應(yīng)用于臨床檢測。酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)是蛋白質(zhì)定量實(shí)驗(yàn)的經(jīng)典方法，一般是在96孔板上進(jìn)行，具有較高的穩(wěn)定性與靈敏度。在此基礎(chǔ)上結(jié)合自動化機(jī)械臂，及微點(diǎn)技術(shù)，這就形成了最初的蛋白質(zhì)微陣列芯片。<

4、br>　　 要發(fā)展一種可靠而高效的蛋白質(zhì)芯片，必須有一個(gè)較大量結(jié)合蛋白，同時(shí)較小影響蛋白活性的固定表面。區(qū)別于研究用的蛋白質(zhì)芯片，臨床應(yīng)用的診斷性芯片必須具備成本低、容易生產(chǎn)、容易反應(yīng)、穩(wěn)定性好、均一性強(qiáng)等特點(diǎn)。尋找適合蛋白質(zhì)固定的基底材料，以及高效固定蛋白的方法成為該領(lǐng)域迫切的需求。
　　 對于一種能有效進(jìn)行分析的蛋白質(zhì)芯片的制作來說其中一個(gè)最大的挑戰(zhàn)來自于選擇合適的固相載體以及表面化學(xué)修飾的方法，這種表面能夠與不同性質(zhì)的蛋

5、白質(zhì)結(jié)合，能保持蛋白質(zhì)的完整性、天然結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)活性。一個(gè)理想的蛋白質(zhì)芯片表面必須具有以下幾種優(yōu)點(diǎn)：1、能穩(wěn)定的結(jié)合足量的蛋白或探針；2、保持蛋白或多肽在表面的活性；3、表面構(gòu)型有利于表面蛋白或探針結(jié)合待測液中的靶標(biāo)；4、背景信號要低。
　　 PDMS，聚二甲基硅氧烷Poly(dimethylsiloxane)在生物醫(yī)學(xué)上被廣泛應(yīng)用，這種高分子材料具有化學(xué)惰性、無毒性、容易操作、原材料多、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。如果能對PDMS進(jìn)行表面修

6、飾用于生物芯片的固相材料，將會是一種有效、省時(shí)的可行方法。但是由于PDMS表面的化學(xué)惰性，急需要一種容易的方法能對PDMS進(jìn)行表面修飾。對PDMS的表面修飾方法嘗試了很多，通常分為物理吸附和化學(xué)偶聯(lián)兩大類?；瘜W(xué)偶聯(lián)方法進(jìn)行的修飾比較穩(wěn)定，但是在化學(xué)惰性的PDMS表面很難做到。馬宏偉等發(fā)明了一種能夠?qū)DMS表面進(jìn)行永久性和功能性修飾的方法。這種方法是在P DM S制作過程中摻入一種引發(fā)劑，稱為i P D M S。然后采用表面引發(fā)原子力聚

7、合方法(SI-ATRP)在i P D M S表面進(jìn)行P E G修飾，植入O E G M A層。這層修飾層具有很好的抗蛋白非特異性吸附的性能，而且可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)修飾層的厚度和密度，從而調(diào)節(jié)表面的親疏水性。這種經(jīng)過修飾的表面可以用于生物傳感器、微流體芯片、細(xì)胞芯片、蛋白質(zhì)平面芯片等對表面化學(xué)要求很高的領(lǐng)域。
　　 在本研究中，我們試圖在這一種新型的材料上面進(jìn)行蛋白質(zhì)芯片檢測體系的建立，檢測的原理基于雙抗體夾心法，可以同時(shí)檢測超過1

8、0個(gè)指標(biāo)，指標(biāo)為腫瘤標(biāo)志物。整個(gè)研究包括固相載體制備和表面化學(xué)、一抗的固定，多種標(biāo)準(zhǔn)品混合液的制備、多種標(biāo)記抗體混合液的制備、檢測流程的建立，最終獲得一種基于雙抗體夾心法的能并行檢測多種指標(biāo)的蛋白質(zhì)芯片分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠符合臨床檢測的需求。
　　 第一部分iPDMS的制作和表面功能化修飾
　　 這一部分研究的主要目的是制作厚度、硬度適中，表面修飾適合抗體微陣列點(diǎn)樣的iPDMS片基。將sylgard184中的粘性基團(tuán)(A

9、)和硬化劑(B)以及引發(fā)劑v-引發(fā)劑(C)按10∶1∶0.1(A∶B∶C)的比例混合，倒入6.6×7.7 cm的模具在80℃硬化2個(gè)小時(shí)。形成一張半透明的彈性膠狀膜iPDMS。繼續(xù)采用表面引發(fā)聚合技術(shù)，將iPDMS浸入引發(fā)液中在氬氣的保護(hù)下～25℃引發(fā)2個(gè)小時(shí)。引發(fā)液的成分為OEGMA526/CuCl2/Bipy/AscA=20/1/2/1，其中CuCl2的濃度是2.76 mM。已經(jīng)在表面形成多聚OEGMA的iPDMS片基繼續(xù)在1M的溴

10、乙酸和2M的氫氧化鈉溶液中浸泡過夜，在表面生成羧基。經(jīng)過去離子水充分淋洗后用液氮吹干。最后得到的iPDMS膜用XPS掃描，其表面原子的組成符合計(jì)算值，韌性為Young's系數(shù)E∽2.12 MPa，表面接觸角θ∽°±0.4°，用橢圓偏振法測定其表面的OEGMA修飾層的厚度大約為311.4±4.8A。
　　 第二部分蛋白質(zhì)芯片聯(lián)合檢測系統(tǒng)的建立
　　 蛋白質(zhì)芯片檢測系統(tǒng)包括點(diǎn)有蛋白質(zhì)微陣列的芯片、多種抗原的混合標(biāo)準(zhǔn)品、多種酶

11、標(biāo)二抗的混合液、化學(xué)發(fā)光底物以及其他的試劑。同時(shí)也包括檢測流程、信號閱讀儀器和數(shù)據(jù)處理軟件。
　　 首先是將表面已經(jīng)經(jīng)過修飾的iPDMS用0.1M EDC和0.1 M NHS混合液活化30分鐘。然后用HD-2003A點(diǎn)樣儀將12種腫瘤標(biāo)志物的一抗點(diǎn)至iPDMS上，并且用NC作為對照。點(diǎn)樣環(huán)境為溫度24C和濕度45％。點(diǎn)樣的抗體的排列、抗體的稀釋度和稀釋液根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)節(jié)。12種混合標(biāo)準(zhǔn)品采用凍干的方法，濃度用各種參比方法測定。其

12、他的試劑根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)配。檢測儀使用制冷的CCD攝像頭，數(shù)據(jù)處理軟件為Bioca5.0。
　　 在這一部分研究工作中，我們制備了一種能檢測12種腫瘤標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)，12種腫瘤標(biāo)志物包括CA19-9，CA242，AFP，NSE，CEA，CA125，CA15-3，CA72-4，c-PSA，β-HCG，SCC和CK19。每個(gè)指標(biāo)的濃度和信號之間呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系。各指標(biāo)的配對抗體和其他不相關(guān)抗原之間未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。而且由

13、于iPDMS的彈性性質(zhì)和抗非特異性蛋白吸附的性能，使得芯片的裝配和反應(yīng)比NC簡單，生產(chǎn)過程中不需要封閉環(huán)節(jié)，在用ELISA法檢測抗原的過程中清洗的步驟變得尤為簡單。
　　 第三部分：蛋白質(zhì)芯片制作和ELISA反應(yīng)的參數(shù)優(yōu)化
　　 影響蛋白質(zhì)芯片質(zhì)量的因素很多，主要包括固相載體和表面化學(xué)、點(diǎn)樣稀釋液、反應(yīng)流程等。我們需要對這些環(huán)節(jié)的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，以達(dá)到最佳的應(yīng)用效果。首先是iPDMS表面的親水性，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)接觸角處在42°

14、-48°范圍內(nèi)時(shí)，比較適合IgG的結(jié)合，過高的親水性會造成環(huán)形點(diǎn)，過高的疏水性使蛋白無法結(jié)合?？贵w的點(diǎn)樣濃度控制在飽和結(jié)合量以下，過高的抗體濃度超過了iPDMS表面的承載能力，會引起蛋白溢出，形成拖尾。通常iPDMS表面抗體的結(jié)合飽和濃度在0.2mg/ml左右，每種指標(biāo)的一抗也進(jìn)行了飽和點(diǎn)樣濃度的確定。在抗體的稀釋液中適當(dāng)添加1％的甘油、0.1％的tritonX-100、3％的甘露醇可以有效地改善點(diǎn)形、提高點(diǎn)的信號，延長蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

15、在點(diǎn)樣結(jié)束后，將蛋白質(zhì)芯片放置于氮?dú)?，合適的溫度和濕度，以及延長放置時(shí)間，都有助于蛋白質(zhì)在iPDMS表面的充分結(jié)合，保持抗體免疫學(xué)活性。在檢測流程中，我們在化學(xué)發(fā)光底物中也添加了表面活性劑，改善了化學(xué)發(fā)光底物在iPDMS表面的流動，消除了由于化學(xué)發(fā)光底物流動造成的芯片圖像霧狀現(xiàn)象。
　　 第四部分以iPDMS為基底的蛋白質(zhì)芯片的檢測性能研究
　　 作為診斷試劑，最重要的還是產(chǎn)品的質(zhì)量。對于蛋白質(zhì)芯片定量系統(tǒng)來說，首先必須

16、符合臨床檢測的要求。性能的評估內(nèi)容包括化學(xué)敏感度、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等。由于iPDMS的抗非特異性吸附的能力，基底的背景接近于零，使得LOD明顯降低，敏感度增強(qiáng)，有些指標(biāo)的LOD甚至達(dá)到了20pg/ml，對于臨床應(yīng)用的大部分指標(biāo)來說，這一敏感度已經(jīng)完全足夠了。一次檢測并行孔和多次檢測之間的CV值均小于15％，符合免疫學(xué)檢測的精密度要求。穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)在4℃至少可以存放半年以上，37℃存放1周，蛋白質(zhì)芯片的信號