Fucoidan對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞誘導(dǎo)的淋巴管生成的抑制作用.pdf

1、目的:
　　胃癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，胃癌轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是胃癌難以治愈的主要原因。胃癌轉(zhuǎn)移方式有多種，淋巴道轉(zhuǎn)移是其中一種主要方式。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成構(gòu)成了腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)即腫瘤誘導(dǎo)的淋巴管新生。靶向胃癌誘導(dǎo)的淋巴管新生促進(jìn)淋巴道的轉(zhuǎn)移在扼制胃癌發(fā)展方面有著至關(guān)重要的作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移中，腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用影響著淋巴管的生成以及腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。腫瘤沿淋巴道轉(zhuǎn)移細(xì)

2、胞分子機(jī)制和相關(guān)藥物研制已成為新的研究熱點(diǎn)。
　　褐藻多糖硫酸酯(fucoidan)是一種含有豐富硫酸基團(tuán)的，具有多種生物學(xué)活性的海洋褐藻類多糖。研究發(fā)現(xiàn)，fucoidan在抗腫瘤方面有著良好的效果，并且與傳統(tǒng)的化療藥物相比較，因其產(chǎn)自天然所以毒副作用較小。
　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)及其受體血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(VEGFR-3)是促進(jìn)淋巴管新生的重要因素?；|(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(

3、MMP-9)和金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)參與降解細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路是一條與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)的信號(hào)通路，能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。趨化因子1(CXCL1)是一種能夠促進(jìn)腫瘤侵襲和進(jìn)一步提高惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的趨化因子。
　　方法:
　　1.采用MTT法檢測(cè)fucoidan對(duì)SGC7901細(xì)胞活力的影響，同時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry)檢測(cè)

4、fucoidan對(duì)SGC7901細(xì)胞周期的影響。
　　2.采用Transwell小室法檢測(cè)fucoidan對(duì)SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　3.采用ELISA法檢測(cè)fucoidan對(duì)SGC7901細(xì)胞分泌的MMP-2，MMP-9，TIMP-1和VEGF-C的影響，采用RT-PCR法檢測(cè)fucoidan對(duì)SGC7901細(xì)胞VEGF-CmRNA水平的影響。
　　4.Western blot檢測(cè)fucoidan

5、對(duì)SGC7901細(xì)胞中信號(hào)通路NF-κB/PI3K/Akt的影響。
　　5.采用共培養(yǎng)方法檢測(cè)fucoidan對(duì)SGC7901細(xì)胞對(duì)HLEC細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)形成能力的影響，采用Western blot檢測(cè)共培養(yǎng)體系下，fucoidan對(duì)HLEC細(xì)胞中VEGFR-3和p-AKT蛋白水平的影響。
　　6.Transwell小室法檢測(cè)CXCL1對(duì)SGC7901細(xì)胞侵襲能力的影響，ELISA法檢測(cè)fucoidan作用下CXCL1對(duì)SGC

6、7901細(xì)胞MMP-2的分泌的影響，免疫熒光法檢測(cè)fucoidan對(duì)裸鼠體內(nèi)CXCL1的表達(dá)水平的影響。
　　7.SGC7901胃腺癌細(xì)胞建立裸鼠腫瘤模型，免疫熒光雙標(biāo)記法檢測(cè)fucoidan對(duì)裸鼠胃腺癌生長(zhǎng)以及淋巴管密度(LVD)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明fucoidan抑制SGC7901細(xì)胞活力。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，fucoidan通過阻滯G0/G1期使細(xì)胞無法轉(zhuǎn)向S期而產(chǎn)生抑制作用。

7、　　2.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示fucoidan抑制SGC7901細(xì)胞遷移侵襲能力。
　　3.ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明fucoidan抑制SGC7901細(xì)胞MMP-2，MMP-9，TIMP-1和VEGF-C的分泌。RT-PCR結(jié)果顯示在mRNA水平，fucoidan抑制vegf-c的表達(dá)。
　　4.Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明fucoidan能夠下調(diào)PI3K,Akt磷酸化水平的表達(dá)以及NF-κB蛋白表達(dá)從而影響

8、PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)。
　　5.共培養(yǎng)條件下，成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示fucoidan能夠抑制SGC7901細(xì)胞與HLEC細(xì)胞共培養(yǎng)下HLEC細(xì)胞的成管能力。Western blot結(jié)果顯示fucoidan下調(diào)HLEC中VEGFR-3和p-AKT表達(dá)。
　　6.Transwell和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明fucoidan抑制CXCL1對(duì)SGC7901細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用，免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示fucoidan抑制裸鼠腫瘤