β-萘黃酮細胞特異性影響大鼠GCLC基因表達.pdf

1、谷胱甘肽（GSH）是一種巰基化合物，是體內(nèi)重要的抗氧化，抗炎物質(zhì)。通過谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase）的催化作用清除體內(nèi)多余的氧自由基。Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是合成GSH的限速酶，其催化亞基GCLC具有全酶活性，所以致力于對GCLC基因表達調(diào)控的研究對于了解體內(nèi)GSH水平變化機制有重要意義。有報道指出β-萘黃酮（β-NF）作用人類HeG-2細胞后，可以上調(diào)GCLC基因表達水平。其機理在通

2、過改變轉錄因子的氧化還原狀態(tài)，使得抗氧化元件（ARE）與轉錄因子Nrf2結合，促進GCLC基因表達，從而促進γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)水平來促進體內(nèi)GSH的生物合成。我們在研究中，為了解能夠刺激大鼠GCLC基因表達的作用途徑，選用多種可能的刺激因子進行篩選，發(fā)現(xiàn)β-NF作用于大鼠細胞具有獨特的特點，而在大鼠GCLC基因5’上游調(diào)控序列啟動子區(qū)域內(nèi)缺少ARE元件。基于這樣的情況，我們對這一現(xiàn)象進行了初步分析，以探討大鼠GCLC

3、基因表達調(diào)控的特征。
　　 目的：
　　 在于研究外界刺激因子β-NF在作用濃度范圍內(nèi)對GCLC基因在大鼠RTE細胞和H4ⅡE細胞中差異性表達的影響，從而了解β-NF調(diào)控γ-GCS基因轉錄調(diào)節(jié)機制。
　　 方法：
　　 1、刺激因子的篩選：將GCLC基因上游調(diào)控序列驅動的GCLC-PGL3-enhancer-Luciferase報道載體與PRL-sv40海腎熒光素酶內(nèi)參表達質(zhì)粒分別共轉染大鼠支氣管上皮細胞

4、(RTE)、大鼠肝癌細胞（H4ⅡE）細胞。待轉染12h后，將Bap，TNF-α，GSH，GSSG，Cysteamine，Cystamine，β-NF，α-NF按照所需濃度梯度刺激細胞12h，同時設定DMSO空白對照組。將每種刺激因子在不同濃度作用下的標準化熒光素酶活性值與標準化空白對照組熒光素酶活性值做比較，篩選出對上述兩細胞都發(fā)揮調(diào)控效應的刺激因子及作用濃度。
　　 2、熒光定量PCR檢測：分別比較RTE細胞和H4ⅡE細胞中，

5、β-NF實驗組相對于DMSO空白對照組γ-GCS的mRNA變化倍數(shù)。
　　 3、確定刺激因子作用區(qū)間：轉染大鼠GCLC基因5’上游調(diào)控序列啟動子區(qū)域內(nèi)r系列缺失載體，12h后添加刺激因子，同時設定空白對照組。檢測熒光素酶活性值同上。
　　 4、作用區(qū)間內(nèi)報道載體的構建及轉染：點突變NF-κB/AP-1核心元件報道載體的構建是以GCLC-luc (-1758～+2) 為模板，按照引物導入核心序列突變的方法，通過兩次PCR擴

6、增出突變-380～-375和-357～-352的NF-κB/AP-1元件的片段。2種PCR產(chǎn)物膠回收后連入pGEM-T easy載體，以Sac I/Xho I雙酶切插入PGL3-enhancer載體鑒定并測序。轉染步驟同3。
　　 5、刺激因子作用下激酶信號轉導通路的篩選：兩種細胞培養(yǎng)傳代，分別接種于48孔細胞培養(yǎng)板中，12h后添加激酶抑制劑（SB-202358、kenpaullone、k-252a），設定空白對照組。轉染步驟同

7、3。
　　 6、免疫蛋白印跡(Western Blot)方法檢測刺激因子作用下細胞內(nèi)γ-GCS蛋白、GSK-3β蛋白表達水平。
　　 結果：
　　 1、轉染GCLC-luc到大鼠支氣管上皮細胞(RTE)和大鼠肝癌細胞（H4ⅡE），12h后添加不同濃度梯度的各刺激因子。在兩種細胞中，β-NF（1～100uM）對GCLC基因表達均具有調(diào)控作用，而其他刺激因子在各個濃度梯度范圍內(nèi)沒有影響GCLC基因的表達。在大鼠支氣管

8、上皮細胞(RTE)，β-NF（1 uM，10 uM，100uM）刺激后GCLC-luc在細胞內(nèi)螢光素酶活性水平較DMSO空白對照組分別下降了1.61、9.43、16.44倍（P＜0.01）。在大鼠肝癌細胞（H4ⅡE），β-NF（1 uM，10 uM，100uM）刺激后GCLC-luc在細胞內(nèi)螢光素酶活性水平較DMSO空白對照組上升了1.55、3.73、3.83倍（P＜0.05）。Β-NF（1～100uM）對RTE細胞GCLC基因表達有劑

9、量依賴性抑制作用，對H4ⅡE細胞GCLC基因表達有劑量依賴性上調(diào)作用。
　　 2、β-NF刺激改變細胞內(nèi)源性γ-GCS的mRNA水平，在大鼠支氣管上皮細胞(RTE)中，實驗組γ-GCS的mRNA表達量是空白對照組的2-0.4 倍（P＜0.05）。在大鼠肝癌細胞（H4ⅡE）中，實驗組γ-GCS的mRNA表達量是空白對照組的21.03 倍（P＜0.05）。Β-NF（10uM）在轉錄水平影響兩種細胞內(nèi)源性γ-GCS基因的表達。在RTE

10、細胞中的抑制，以及在H4ⅡE細胞中的促進表達作用。
　　 3、將GCLC基因5’上游調(diào)控序列啟動子區(qū)域內(nèi)r系列缺失載體分別轉染兩種細胞，在大鼠支氣管上皮細胞(RTE)中，轉染GCLCL-luc、5r、2r、8r、11r、12r、15a載體，處理組熒光素值較空白對照組熒光素均依次下降了7.84、15.82、12.74、11.02、16.44、10.33、12.22倍（P＜0.01），大鼠肝癌細胞（H4ⅡE）中均依次上升了1.82、

11、1.58、1.86、1.59、2.53、2.82、2.41倍（P＜0.05）。（-1780bp～-390bp）區(qū)間內(nèi)，兩種細胞處理組熒光素值與空白對照組熒光素均差異顯著。說明β-NF在這一區(qū)間并沒有作用位點，從β-NF依舊影響GCLC基因的表達，可能作用位點在15a之后的區(qū)間即（-390bp～+2bp）。
　　 4、將構建成功的GCLC-mut AP-1（-357～-352）–luc、GCLC-mutNF-κB（-380～-37

12、5）-luc 以及GCLC-Luc報道載體轉染RTE細胞和H4ⅡE細胞，設定β-NF處理組和DMSO空白對照組。在RTE細胞中，轉染GCLC-Luc的β-NF處理組較空白對照組下調(diào)11.7倍，而GCLC-mut AP-1 –luc、GCLC-mutNF-κB-luc轉染后分別下降了15.7倍和12.7倍，下降幅度沒有減少，說明此兩個元件與β-NF的作用無關。在H4ⅡE細胞中，轉染GCLC-Luc的β-NF處理組熒光素酶值較空白對照組上調(diào)

13、3.98倍，轉染后GCLC-mut AP-1 –luc上升了2.36倍，上升幅度小于野生型（P＜0.05）。轉染后GCLC-mutNF-κB-luc上升了4.67倍，上升幅度沒有減少，可見，在H4ⅡE細胞中突變AP-1后β-NF上調(diào)GCLC基因表達能力低于對野生型的調(diào)控,β-NF影響GCLC基因的表達與AP-1作用元件有一定關系。
　　 5、在RTE細胞中，kenpaullone（2～20uM）能明顯改變β-NF(10uM)對G

14、CLC基因表達的抑制作用，kenpaullone（2、10、20uM）+β-NF(10uM)較β-NF(10uM)的細胞內(nèi)熒光素酶活性有明顯的改變，分別上升了5.28、6.34、6.14倍（P＜0.01），而其他兩種激酶抑制劑則沒有發(fā)揮作用，在H4ⅡE細胞中這三種抑制劑都沒有發(fā)揮可見效應。已知Kenpaullone是GSK-3β磷酸化位點抑制劑，可見在RTE細胞中，β-NF對GCLC基因表達的抑制作用是通過GSK-3β激酶信號轉導通路實