內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)啟動(dòng)子的克隆.pdf

1、血友病A是由于凝血因子Ⅷ(hFⅧ)的功能缺陷導(dǎo)致的一種單基因遺傳病。該遺傳病的基因治療策略一般是通過基因?qū)氲姆绞绞共∪思?xì)胞能夠表達(dá)正常的FⅧ。在這個(gè)過程中，組成型啟動(dòng)子(constitutive promoter)常常用來啟動(dòng)FⅧ的表達(dá)。但是在以往的研究中我們發(fā)現(xiàn)，組成型啟動(dòng)子在某些特定的細(xì)胞類型中并不能夠有效地啟動(dòng)下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
　　 組織特異啟動(dòng)子(tissue-specific promoter)，不同于組成型啟動(dòng)

2、子。在這類啟動(dòng)子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性，因此也有著一些不可替代的優(yōu)勢(shì)。由于在正常機(jī)體內(nèi)，F(xiàn)Ⅷ特異性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，因此我們?cè)噲D克隆內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)啟動(dòng)子，并建立含有內(nèi)皮細(xì)胞特異啟動(dòng)子啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)系，用于后續(xù)hESCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化及血友病A基因治療的研究。
　　 目的:構(gòu)建并驗(yàn)證含有內(nèi)皮細(xì)胞特

3、異性表達(dá)報(bào)告基因的質(zhì)粒。
　　 方法:1.建立從外周血、臍血、臍靜脈中分離和培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的方法;2.構(gòu)建GFP內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)質(zhì)粒。分別PCR擴(kuò)增內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)基因vWF、VE-cadherin(CD144)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游啟動(dòng)子片段。用pEGFP-N1載體為骨架，以內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)基因的啟動(dòng)子完全取代CMV啟動(dòng)子，構(gòu)建4個(gè)質(zhì)粒:pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、 pVE-2;3.用這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染新分離的原代內(nèi)皮細(xì)

4、胞、Huvec細(xì)胞系、hESCs證明其表達(dá)的特異性。
　　 結(jié)果:1.分別從外周血、臍血、臍靜脈中分離得到可以在體外培養(yǎng)的具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性的細(xì)胞，建立穩(wěn)定獲取內(nèi)皮細(xì)胞的方法;2.所構(gòu)建的載體pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、pVE-2經(jīng)酶切鑒定，所獲得酶切片段的大小與預(yù)期值相符;3.所構(gòu)建的載體pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、pVE-2測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列相符;4.構(gòu)建好的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染新分離的原代內(nèi)皮細(xì)胞、Huve