內皮細胞特異性表達啟動子的克隆.pdf

1、血友病A是由于凝血因子Ⅷ(hFⅧ)的功能缺陷導致的一種單基因遺傳病。該遺傳病的基因治療策略一般是通過基因導入的方式使病人細胞能夠表達正常的FⅧ。在這個過程中，組成型啟動子(constitutive promoter)常常用來啟動FⅧ的表達。但是在以往的研究中我們發(fā)現(xiàn)，組成型啟動子在某些特定的細胞類型中并不能夠有效地啟動下游結構基因的表達。
　　 組織特異啟動子(tissue-specific promoter)，不同于組成型啟動

2、子。在這類啟動子調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現(xiàn)出發(fā)育調節(jié)的特性，因此也有著一些不可替代的優(yōu)勢。由于在正常機體內，F(xiàn)Ⅷ特異性表達于內皮細胞，因此我們試圖克隆內皮細胞特異性表達啟動子，并建立含有內皮細胞特異啟動子啟動報告基因表達的人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)系，用于后續(xù)hESCs向內皮細胞分化及血友病A基因治療的研究。
　　 目的:構建并驗證含有內皮細胞特

3、異性表達報告基因的質粒。
　　 方法:1.建立從外周血、臍血、臍靜脈中分離和培養(yǎng)內皮細胞的方法;2.構建GFP內皮細胞特異表達質粒。分別PCR擴增內皮細胞特異性表達基因vWF、VE-cadherin(CD144)轉錄起始位點上游啟動子片段。用pEGFP-N1載體為骨架，以內皮細胞特異性表達基因的啟動子完全取代CMV啟動子，構建4個質粒:pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、 pVE-2;3.用這些質粒分別轉染新分離的原代內皮細

4、胞、Huvec細胞系、hESCs證明其表達的特異性。
　　 結果:1.分別從外周血、臍血、臍靜脈中分離得到可以在體外培養(yǎng)的具有內皮細胞特異性的細胞，建立穩(wěn)定獲取內皮細胞的方法;2.所構建的載體pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、pVE-2經酶切鑒定，所獲得酶切片段的大小與預期值相符;3.所構建的載體pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、pVE-2測序結果與預期序列相符;4.構建好的質粒分別轉染新分離的原代內皮細胞、Huve