RNA干擾技術特異性抑制大鼠VSMC骨橋蛋白基因表達的研究.pdf

1、第一部分 大鼠VSMC的體外培養(yǎng)及鑒定 目的:體外分離Sprague-Dawley大鼠胸主動脈平滑肌細胞，建立血管平滑肌細胞體外培養(yǎng)模型。 方法:無菌下取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠胸主動脈，清除外膜組織和內(nèi)膜，采用組織塊翻轉(zhuǎn)干涸培養(yǎng)法進行培養(yǎng)。2周后進行傳代，細胞爬片行免疫組織化學鑒定。 結論:采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞簡單易行，且又經(jīng)濟，可為后續(xù)實驗提供細胞來源。

2、第二部分 骨橋蛋白特異性短發(fā)夾RNA的設計與合成 目的:在線設計針對骨橋蛋白siRNA的序列，采用體外轉(zhuǎn)錄的方法，獲得發(fā)夾狀RNA，為下一步的細胞轉(zhuǎn)染奠定基礎。 方法:在NCBI(http：/awww.ncbi.nlm.nih.gov/)的Nucleotide庫中檢索有關大鼠骨橋蛋白的mRNA序列。DharmaconsiDESIGNCenter按照網(wǎng)頁要求和提示設計siRNA，選擇其中的兩條siRNA序列(shR

3、NA1和shRNA2)。按照MessageMuterTMshRNAiProductionKit的說明設計DNA寡核苷酸，進行退火反應、延伸反應、體外轉(zhuǎn)錄反應和RNA純化。此外，還合成了針對熒光素酶基因的陰性對照產(chǎn)物luc-shRNA。將合成產(chǎn)物在12％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定產(chǎn)物。在紫外分光光度計上OD260和OD280讀取吸光度值，計算shRNA的產(chǎn)量(1OD260=40μgRNA)。 結論:成功合成一條針對大鼠骨橋蛋白基因

4、的發(fā)夾狀RNA和一條作為陰性對照實驗的發(fā)夾狀RNA。 第三部分 短發(fā)夾RNA抑制大鼠VSMC骨橋蛋白基因表達的研究 目的:將骨橋蛋白特異性shRNA轉(zhuǎn)染大鼠VSMC，檢測骨橋蛋白基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達情況。 方法:實驗分為三組：(1)空白對照組，僅加入RNAiFectTransfectionReagent(2)陰性對照組，加入RNAiFectTransfectionReagent+luc-shR

5、NA(3)RNAi組，RNAiFectTransfectionReagent+OPN-shRNA。在VSMC融合60％時轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)染。48h后，利用Trizol試劑分別提取各組細胞總RNA和總蛋白。通過RT-PCR檢測骨橋蛋白基因mRNA的表達；Westernblot方法檢測其蛋白質(zhì)的表達。RT-PCR擴增產(chǎn)物在0.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳并進行半定量分析。 結論:通過體外轉(zhuǎn)錄合成的骨橋蛋白特異性短發(fā)夾RNA成功地轉(zhuǎn)染到大鼠VS

6、MC中，并高效、特異性抑制了骨橋蛋白基因的表達，達到基因沉默的目的。 第四部分 短發(fā)夾RNA對大鼠VSMC增殖、黏附及遷移能力的影響 目的:在利用RNAi技術抑制血管平滑肌細胞OPN基因表達的基礎上，研究血管平滑肌細胞增殖、遷移和黏附特性的改變。 方法:采用MTT法檢測細胞增殖，各組于24h和、48h和72h在490nm波長測量吸光度(A490)。1％層黏連蛋白包被96孔培養(yǎng)板，分別在轉(zhuǎn)染4h、6h、8h

7、后檢測吸光度(A490)。采用Boyden's小室檢測遷移能力的變化。轉(zhuǎn)染48h后，將遷移至下室面的VSMC用4％多聚甲醛固定，PBS洗滌，蘇木素、伊紅染色。在顯微鏡下計數(shù)，每張濾膜隨機取5個高倍視野(×400)取均值。 結論:OPN特異性shRNA在有效抑制OPN基因后，體外培養(yǎng)VSMC的遷移、黏附和增殖都受到不同程度的抑制。本實驗將為骨橋蛋白介導的血管成形術后再狹窄的基因沉默療法提供實驗基礎。 第五部分 短發(fā)

8、夾RNA對大鼠VSMCⅠ、Ⅲ型膠原合成的影響 目的:檢測VSMC在轉(zhuǎn)染OPN特異性shRNA后，合成Ⅰ、Ⅲ型膠原的情況。 方法:細胞轉(zhuǎn)染48h，提取細胞總RNA，RT-PCR檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達。吸取培養(yǎng)上清液，利用ELISA法檢測OPN特異性shRNA對VSMCⅠ、Ⅲ型膠原合成的影響。 結論:出現(xiàn)上述結果的原因，可能是在RNAi組VSMC的數(shù)量在轉(zhuǎn)染后低于兩個對照組，導致VSMC分泌到上清液中的Ⅰ、Ⅲ型