RNA干擾技術(shù)特異性抑制大鼠VSMC骨橋蛋白基因表達(dá)的研究.pdf

1、第一部分 大鼠VSMC的體外培養(yǎng)及鑒定 目的:體外分離Sprague-Dawley大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，建立血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)模型。 方法:無菌下取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠胸主動(dòng)脈，清除外膜組織和內(nèi)膜，采用組織塊翻轉(zhuǎn)干涸培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。2周后進(jìn)行傳代，細(xì)胞爬片行免疫組織化學(xué)鑒定。 結(jié)論:采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞簡單易行，且又經(jīng)濟(jì)，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞來源。

2、第二部分 骨橋蛋白特異性短發(fā)夾RNA的設(shè)計(jì)與合成 目的:在線設(shè)計(jì)針對(duì)骨橋蛋白siRNA的序列，采用體外轉(zhuǎn)錄的方法，獲得發(fā)夾狀RNA，為下一步的細(xì)胞轉(zhuǎn)染奠定基礎(chǔ)。 方法:在NCBI(http：/awww.ncbi.nlm.nih.gov/)的Nucleotide庫中檢索有關(guān)大鼠骨橋蛋白的mRNA序列。DharmaconsiDESIGNCenter按照網(wǎng)頁要求和提示設(shè)計(jì)siRNA，選擇其中的兩條siRNA序列(shR

3、NA1和shRNA2)。按照MessageMuterTMshRNAiProductionKit的說明設(shè)計(jì)DNA寡核苷酸，進(jìn)行退火反應(yīng)、延伸反應(yīng)、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和RNA純化。此外，還合成了針對(duì)熒光素酶基因的陰性對(duì)照產(chǎn)物luc-shRNA。將合成產(chǎn)物在12％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定產(chǎn)物。在紫外分光光度計(jì)上OD260和OD280讀取吸光度值，計(jì)算shRNA的產(chǎn)量(1OD260=40μgRNA)。 結(jié)論:成功合成一條針對(duì)大鼠骨橋蛋白基因

4、的發(fā)夾狀RNA和一條作為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的發(fā)夾狀RNA。 第三部分 短發(fā)夾RNA抑制大鼠VSMC骨橋蛋白基因表達(dá)的研究 目的:將骨橋蛋白特異性shRNA轉(zhuǎn)染大鼠VSMC，檢測(cè)骨橋蛋白基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。 方法:實(shí)驗(yàn)分為三組：(1)空白對(duì)照組，僅加入RNAiFectTransfectionReagent(2)陰性對(duì)照組，加入RNAiFectTransfectionReagent+luc-shR

5、NA(3)RNAi組，RNAiFectTransfectionReagent+OPN-shRNA。在VSMC融合60％時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染。48h后，利用Trizol試劑分別提取各組細(xì)胞總RNA和總蛋白。通過RT-PCR檢測(cè)骨橋蛋白基因mRNA的表達(dá)；Westernblot方法檢測(cè)其蛋白質(zhì)的表達(dá)。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并進(jìn)行半定量分析。 結(jié)論:通過體外轉(zhuǎn)錄合成的骨橋蛋白特異性短發(fā)夾RNA成功地轉(zhuǎn)染到大鼠VS

6、MC中，并高效、特異性抑制了骨橋蛋白基因的表達(dá)，達(dá)到基因沉默的目的。 第四部分 短發(fā)夾RNA對(duì)大鼠VSMC增殖、黏附及遷移能力的影響 目的:在利用RNAi技術(shù)抑制血管平滑肌細(xì)胞OPN基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，研究血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和黏附特性的改變。 方法:采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，各組于24h和、48h和72h在490nm波長測(cè)量吸光度(A490)。1％層黏連蛋白包被96孔培養(yǎng)板，分別在轉(zhuǎn)染4h、6h、8h

7、后檢測(cè)吸光度(A490)。采用Boyden's小室檢測(cè)遷移能力的變化。轉(zhuǎn)染48h后，將遷移至下室面的VSMC用4％多聚甲醛固定，PBS洗滌，蘇木素、伊紅染色。在顯微鏡下計(jì)數(shù)，每張濾膜隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(×400)取均值。 結(jié)論:OPN特異性shRNA在有效抑制OPN基因后，體外培養(yǎng)VSMC的遷移、黏附和增殖都受到不同程度的抑制。本實(shí)驗(yàn)將為骨橋蛋白介導(dǎo)的血管成形術(shù)后再狹窄的基因沉默療法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第五部分 短發(fā)

8、夾RNA對(duì)大鼠VSMCⅠ、Ⅲ型膠原合成的影響 目的:檢測(cè)VSMC在轉(zhuǎn)染OPN特異性shRNA后，合成Ⅰ、Ⅲ型膠原的情況。 方法:細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)。吸取培養(yǎng)上清液，利用ELISA法檢測(cè)OPN特異性shRNA對(duì)VSMCⅠ、Ⅲ型膠原合成的影響。 結(jié)論:出現(xiàn)上述結(jié)果的原因，可能是在RNAi組VSMC的數(shù)量在轉(zhuǎn)染后低于兩個(gè)對(duì)照組，導(dǎo)致VSMC分泌到上清液中的Ⅰ、Ⅲ型