表皮干細(xì)胞分化的miR-378b調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　皮膚是人體最大的器官，位于機(jī)體內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境的界面上，是機(jī)體重要的屏障保護(hù)器官。皮膚分為表皮和真皮。表皮終生不斷自我更新，其基底層的干細(xì)胞持續(xù)增殖分化以取代外層終末分化細(xì)胞，從而進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的更新，外層細(xì)胞的死亡脫落與基底干細(xì)胞的分裂維持一定的平衡，這是維持正常的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本要求。
　　表皮干細(xì)胞分化在mRNA水平上需要進(jìn)行大量的協(xié)調(diào)，涉及各類mRNA表達(dá)增強(qiáng)或減弱，許多信號(hào)通路上調(diào)或抑制

2、。這一過程發(fā)生故障可能導(dǎo)致災(zāi)難性的后果。
　　NKX3.1是前列腺細(xì)胞特異表達(dá)的、受雄激素調(diào)節(jié)的同源盒基因，在前列腺胚胎發(fā)育、上皮分化及腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。NKX3.1在前列腺，氣管，睪丸，睪丸生殖細(xì)胞，睪丸曲細(xì)精管等組織細(xì)胞中有表達(dá)，未見在表皮干細(xì)胞中表達(dá)的報(bào)道。
　　人類基因組約有98％的RNA能轉(zhuǎn)錄但不能翻譯為蛋白質(zhì)。人們將這些可以轉(zhuǎn)錄卻不能編碼蛋白的RNA稱為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRN

3、A)。非編碼RNA包括:rRNA、tRNA、miRNA、siRNA、piRNA、lncRNA等多種RNA分子。非編碼RNA具有重要的調(diào)控功能，如生物體生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、細(xì)胞增殖分化及凋亡以及多種疾病的發(fā)生等。
　　MicroRNA(miRNA)是一種重要的非編碼RNA，廣泛存在于多種生物物種中，起重要基因表達(dá)調(diào)控作用。長(zhǎng)度約為21～25個(gè)堿基。成熟的miRNA5'端2～8個(gè)相對(duì)恒定的核苷酸稱“種子序列”，miRNA通過“種子序列

4、”與靶基因mRNA的特異性堿基配對(duì)，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。miRNA在進(jìn)化過程中具有高度保守性，其表達(dá)具有時(shí)序性和組織特異性。
　　與表皮分化有關(guān)的miRNA有miR-203、miR-24、miR-17家族、miR-31等。miR-203是一類表皮特異性表達(dá)的miRNA。體內(nèi)和體外的功能性實(shí)驗(yàn)證明，miR-203對(duì)增殖的皮膚干細(xì)胞和祖細(xì)胞存在有效的抑制作用。miR-203可導(dǎo)致細(xì)胞周期退化

5、和克隆能力的顯著降低，促進(jìn)干細(xì)胞分化為各類細(xì)胞。miR-24通過控制肌動(dòng)蛋白粘附和細(xì)胞遷移促進(jìn)表皮分化。
　　人miR-378b位于第3號(hào)染色體上，是miR-378家族的一員，與miR-378(即miR-378a)的種子序列相同。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-378參與細(xì)胞分化過程的調(diào)控。但是miR-378b及NKX3.1與表皮干細(xì)胞分化的關(guān)系，至今未見報(bào)道。
　　本文擬通過基因芯片對(duì)表皮干細(xì)胞分化過程中mRNA和miRNA變化進(jìn)行分

6、析，對(duì)mRNA和miRNA調(diào)控表皮干細(xì)胞分化的機(jī)制及miR-378b和NKX3.1與表皮干細(xì)胞分化的關(guān)系進(jìn)行研究。
　　方法：
　　一、誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞分化，研究分化過程中mRNA表達(dá)譜的變化。
　　1.分離培養(yǎng)表皮干細(xì)胞，免疫熒光法檢測(cè)CK19表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)CK19，CD90細(xì)胞比例。
　　2.使用1.5mM Ca2+處理表皮干細(xì)胞120h， qPCR方法檢測(cè)K1、K10、involucrin、fila

7、ggrin基因表達(dá)變化。免疫熒光法檢測(cè)表皮分化細(xì)胞loricrin，involucrin蛋白表達(dá)。
　　3.應(yīng)用mRNA芯片分析表皮干細(xì)胞分化過程中mRNA表達(dá)譜的變化。
　　4.使用qPCR方法檢測(cè)Desmocollin1、Decorin、S100P、Desmoglein1、CCND1、CTNNB1、FZD4、LRP5基因表達(dá)變化，驗(yàn)證mRNA芯片結(jié)果。
　　5.使用GO analysis，Pathway Analy

8、sis方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　二、建立表皮干細(xì)胞分化過程中miRNA表達(dá)譜，研究miR-378b在表皮干細(xì)胞分化過程中的作用。
　　1.miRNA提取及質(zhì)量控制。
　　2.使用Exiqon公司miRCURY LNATM microRNA Array，7th gen-hsa，mmu&rno芯片檢測(cè)miRNA表達(dá)差異。
　　3.使用qPCR方法檢測(cè)miR-378b等18個(gè)miRNA表達(dá)變化，驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果。<

9、br>　　4.采用miR-378b模擬物轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞，qPCR方法檢測(cè)K1、K10、involucrin、filaggrin基因表達(dá)變化，Western blot檢測(cè)CK10、involucrin蛋白表達(dá)變化。采用miR-378b抑制物轉(zhuǎn)染高鈣誘導(dǎo)分化的表皮干細(xì)胞，qPCR方法檢測(cè)K1、K10、involucrin、filaggrin基因表達(dá)變化。
　　5.使用軟件預(yù)測(cè)miR-378b的靶基因。
　　6.使用qPCR方法檢

10、測(cè)表皮干細(xì)胞分化過程中NKX3.1 mRNA表達(dá)變化，使用Western blot方法檢測(cè)表皮干細(xì)胞分化過程中NKX3.1蛋白表達(dá)變化。
　　7.雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-378b靶基因。
　　8.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表皮干細(xì)胞過表達(dá)miR-378b和siNKX3.1干擾后細(xì)胞遷移情況。
　　9.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表皮干細(xì)胞過表達(dá)miR-378b和siNKX3.1干擾后細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果：
　　一、獲得了表皮干細(xì)

11、胞分化過程中mRNA表達(dá)譜。
　　1.分離培養(yǎng)獲得了表皮干細(xì)胞。
　　2.采用高鈣誘導(dǎo)成功建立了表皮干細(xì)胞分化模型。表皮干細(xì)胞分化后CK1，CK10，Involucrin，F(xiàn)ilaggrin基因表達(dá)明顯增加。
　　3.qPCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表皮干細(xì)胞分化后Desmocollin1、Decorin、S100P、Desmoglein1基因表達(dá)明顯升高，CCND1、CTNNB1、FZD4、LRP5基因表達(dá)明顯降低，與芯片結(jié)果一

12、致。
　　4.表皮干細(xì)胞分化后，有3129個(gè)mRNA明顯上調(diào)(Fold Change cut-off:2.0);3536個(gè)明顯下調(diào)（Fold Change cut-off:2.0）。
　　5.GO分析顯示，表皮干細(xì)胞分化后，與角質(zhì)細(xì)胞分化、上皮發(fā)育、上皮細(xì)胞分化、角質(zhì)化、組織發(fā)育等相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。與細(xì)胞周期階段、細(xì)胞周期進(jìn)程、有絲分裂周期、有絲分裂相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)。
　　6.Pathway分析顯示，表皮干細(xì)胞分化

13、后上調(diào)的信號(hào)通路有22個(gè)，包括脂肪酸延伸通路、緊密連接通路等。表皮干細(xì)胞分化過程中下調(diào)的信號(hào)通路有37個(gè)，包括細(xì)胞周期信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路等。
　　二、獲得了表皮干細(xì)胞分化后miRNA表達(dá)譜，鑒定了一個(gè)表皮干細(xì)胞分化過程中差異表達(dá)的miRNA:miR-378b。預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了miR-378b的一個(gè)靶基因:NKX3.1。
　　1.qPCR方法驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果一致。
　　2.miRNA芯片檢測(cè)表皮干細(xì)胞分化過程中miR

14、NA表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA中表達(dá)明顯上調(diào)的有198個(gè)(Fold Change cut-off:3.0);表達(dá)明顯下調(diào)的有130個(gè)(Fold Change cut-off:3.0)。
　　3.通過多個(gè)軟件預(yù)測(cè)，經(jīng)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明miR-378b的靶基因?yàn)镹KX3.1。
　　4.qPCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表皮干細(xì)胞分化后，NKX3.1 mRNA表達(dá)明顯下降。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表皮干細(xì)胞表達(dá)NKX3.1蛋白

15、，且在表皮干細(xì)胞分化后，NKX3.1蛋白表達(dá)下降。
　　5.劃痕實(shí)驗(yàn)證明和MTT增殖實(shí)驗(yàn)證明表皮干細(xì)胞過表達(dá)miR-378b和siNKX3.1干擾后細(xì)胞遷移能力下降。
　　6.miR-378b模擬物處理5天后，表皮干細(xì)胞分化標(biāo)志性基因K1、K10、involucrin、filaggrin基因表達(dá)上升，K10、involucrin蛋白表達(dá)增加。miR-378b抑制物處理5天后，能夠抑制高鈣誘導(dǎo)的K1、K10、involucri