P物質(zhì)調(diào)控表皮干細(xì)胞β-catenin表達(dá)的機制及其在ESC分化中的作用研究.pdf

1、表皮干細(xì)胞(EpidermalStemCells，ESC)是皮膚發(fā)育、代謝以及損傷修復(fù)的重要細(xì)胞源泉，它不僅決定了表皮的形成和代謝，同時參與了毛囊的形態(tài)發(fā)生、生理周期的維持，以及損傷毛囊的修復(fù)。探討ESC分化機制有助于尋找提高皮膚愈合速度與質(zhì)量的措施，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、提高創(chuàng)傷愈合質(zhì)量。 以往研究證實，ESC中的β-catenin是啟動ESC分化進(jìn)程與分化方向的關(guān)鍵蛋白。β-catenin是Wnt信號通路一種重要的胞內(nèi)糖蛋白，低水平

2、β-catenin是ESC保持干細(xì)胞狀態(tài)的必要條件之一，當(dāng)其表達(dá)上調(diào)后，ESC進(jìn)入分化進(jìn)程[6，7，8，9]，β-catenin高水平表達(dá)的ESC向毛囊方向分化，若去除β-catenin則向表皮細(xì)胞方向分化[10，11,12,13]。了解調(diào)控β-catenin表達(dá)的機制對探討主導(dǎo)ESC的分化方向，促進(jìn)毛囊的修復(fù)與重建的措施，以及開展皮膚組織工程中的毛囊重建均有重要意義。 感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)(substancep，SP)作為一種研究

3、多年的細(xì)胞因子，以往對于它的研究主要集中于作為神經(jīng)遞質(zhì)、激素和調(diào)質(zhì)發(fā)揮的作用[14]。創(chuàng)傷時不僅感覺神經(jīng)末梢釋放SP，同時在組織修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞在神經(jīng)末梢釋放的SP的誘導(dǎo)下，上調(diào)SP基因及蛋白的表達(dá)，作為自分泌信號促進(jìn)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)多種參與愈合的其他細(xì)胞因子及蛋白(EGF、bFGF、β-catenin、VEGF、MMPs、NF-κB和fibronectin等)表達(dá)上調(diào)。 尤其值得注意

4、的是，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SP是誘導(dǎo)ESC分化和遷移的重要細(xì)胞因子。臨床研究也注意到，SP與ESC參與構(gòu)建的毛囊的形態(tài)發(fā)育關(guān)系密切。皮膚注射SP可以誘導(dǎo)萎縮的毛囊再生；耗竭成鼠SP，毛囊會萎縮并消失。基于SP和β-catenin在ESC分化方向調(diào)控中的作用，提示SP可能通過調(diào)控β-catenin表達(dá)實現(xiàn)細(xì)胞外信號到細(xì)胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控ESC分化方向。CK1ε是β-catenin上游調(diào)控蛋白，與Wnt信號通路的GSK3協(xié)同控制β-

5、catenin的Sr45的磷酸化，從而調(diào)控β-catenin表達(dá)；SP與特異性受體NK-R結(jié)合，水解4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)生成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DG)雙信使，而PIP2對CK1ε表達(dá)具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用?；谝陨弦罁?jù)，我們推論：1.SP通過調(diào)節(jié)β-catenin表達(dá)實現(xiàn)對ESC分化的調(diào)控；2).SP對β-catenin的調(diào)節(jié)通過調(diào)控CK1ε表達(dá)來實現(xiàn)。 為了驗證上述假設(shè)，本研究采用ESC培養(yǎng)

6、的離體細(xì)胞模型，利用定量PCR、Westernblot、siRNA基因干擾、流式細(xì)胞檢測等技術(shù)，從蛋白質(zhì)、基因表達(dá)的不同層次，觀察了SP對ESCβ-catenin表達(dá)的調(diào)控作用，并從受體信號通路、ESC表達(dá)SP的自分泌信號機制、CK1ε在介導(dǎo)SP調(diào)控β-catenin中的作用等方面探討SP在調(diào)控ESC分化中的機制。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 第一部分SP對β-catenin表達(dá)的調(diào)控作用 培養(yǎng)的ESC給予10-7M的

7、SP刺激后，利用實時熒光定量PCR(RQ-PCR)和Westernblot技術(shù)檢測ESCβ-catenin基因和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SP刺激后0.5h，ESCβ-catenin基因與蛋白表達(dá)均上調(diào)；刺激后10～14h，β-catenin表達(dá)達(dá)到峰值，與對照組的表達(dá)相比較差異非常顯著。結(jié)論：SP是誘導(dǎo)ESCβ-catenin表達(dá)上調(diào)的重要細(xì)胞因子。 第二部分SP調(diào)控β-catenin表達(dá)的機制 實驗一NK受體在調(diào)控β

8、-catenin表達(dá)中的作用 使用特異性受體阻斷劑同時阻斷SP的NK1受體、NK2受體，以及分別阻斷兩種受體后，給予10-7MSP刺激，采用RQ-PCR和Westernblot檢測β-catenin基因及蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時阻斷NK1受體和NK2受體后，雖給予SP刺激，但是ESCβ-catenin表達(dá)無明顯變化(P＜0.05)，提示SP主要通過NK1和NK2受體調(diào)控β-catenin的表達(dá)。分別阻斷NK1受體和NK2受體后發(fā)

9、現(xiàn)：阻斷NK1受體后給予SP刺激，β-catenin基因表達(dá)在0.5h就上升到0.279×106copy/μl，與對照組的0.151×106copy/μl差異顯著(P＜0.05)，14h后其表達(dá)上升到峰值0.829×106copy/μl，與對照組相比差異非常顯著(P＜0.01)；阻斷NK2受體后給予SP刺激，0.5h后β-catenin基因表達(dá)上升到0.193×106copy/μl，14h也達(dá)峰值，為0.428×106copy/μl。檢

10、測蛋白表達(dá)示：阻斷NK1給予SP刺激后3h，β-catenin蛋白表達(dá)平均光強度值上升到18.62ODU/mm2，24h后達(dá)到峰值(46.55ODU/mm2)，與對照組相比差異非常顯著(P＜0.01)：阻斷NK2受體給予SP刺激后3h，蛋白表達(dá)為15.26ODU/mm2，與對照組相比差異不顯著，24h達(dá)峰值25.59ODU/mm2，與對照間相比差異顯著(P＜0.05)。比較阻斷NK1受體和NK2受體后，β-catenin基因以及蛋白表達(dá)

11、水平，SP刺激10h后，二組差異顯著(P＜0.05)，24h差異非常顯著(P＜0.01)。 上述結(jié)果提示，SP通過NK1受體和NK2受體調(diào)控β-catenin表達(dá)，其中NK2-R發(fā)揮主要作用。 實驗二SP自分泌在β-catenin表達(dá)調(diào)控中的作用研究 1、表皮干細(xì)胞SP表達(dá)的研究 現(xiàn)將細(xì)胞隨機分為NK受體阻斷組(NK-R阻斷劑阻斷)、SP基因阻斷組(siRNA阻斷SP基因)、單純SP組、對照組，前三組分別

12、給予10-7MSP刺激。采用定量PCR和Westernblot技術(shù)分別檢測上述四組SP基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SP刺激后ESC的SP基因和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，基因表達(dá)在刺激后6～10h時達(dá)到峰值1.73×107copy/μl，蛋白表達(dá)則在刺激后18h最高，為59.17ODU/mm2，兩者與對照組比較均有非常顯著差異(P＜0.01)；阻斷NK-R和SP基因后，雖給與SP刺激，SP基因和蛋白表達(dá)也無明顯上調(diào)。從而提示胞外SP與受體結(jié)合可

13、以誘導(dǎo)ESCSP表達(dá)上調(diào)。 2、SP自分泌在β-catenin表達(dá)調(diào)控中的作用研究 采用siRNA基因干擾技術(shù)封閉表皮干細(xì)胞SP基因的表達(dá)，而后給與10-7MSP刺激，再以定量PCR和Westernblot技術(shù)分別檢測ESCβ-catenin基因與蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：當(dāng)封閉SP基因后給予SP刺激，無論β-catenin基因還是蛋白，表達(dá)均只有輕度上調(diào)，與SP組表達(dá)相比有非常顯著差異(P＜0.01)。 上述結(jié)果提

14、示，ESC表達(dá)的SP是作為自分泌信號，在調(diào)控β-catenin表達(dá)中發(fā)揮重要作用。 實驗三CK1ε在SP調(diào)控β-catenin表達(dá)過程中的作用地位 1、SP對于CK1ε表達(dá)的調(diào)控作用及其特點 將培養(yǎng)的ESC隨機分為NK受體阻斷組，SP基因阻斷組，SP組，對照組(見實驗二)。采用定量PCR和Westernblot分別檢測CK1ε基因與蛋白表達(dá)水平，借以探討SP對于CK1ε表達(dá)的調(diào)控作用特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SP組細(xì)胞CK

15、1ε基因表達(dá)在SP刺激后0.5h，上升為0.854×106copy/μl，隨后繼續(xù)上升，刺激后14h達(dá)到最高點1.97×106copy/μl，與對照組相比差異非常顯著(P＜0.01)；NK受體阻斷組和SP阻斷組基因表達(dá)在刺激后均有輕度上升，但是顯著低于單純SP組表達(dá)(P＜0.01)。單純SP組細(xì)胞CK1ε蛋白表達(dá)刺激后24h時上升到最高點62.84ODU/mm2，顯著高于對照組(P＜0.01)；NK-R阻斷組和SP阻斷組蛋白表達(dá)在刺激后

16、均輕度上調(diào)，后者略高于前者，二者之間無統(tǒng)計學(xué)差異，但是這二者均顯著低于單純SP組表達(dá)(P＜0.01)。 上述結(jié)果提示ESC自表達(dá)的SP可作為自分泌信號調(diào)控CK1ε的表達(dá)。 2、SP通過CK1ε調(diào)控β-catenin表達(dá)的實驗研究 培養(yǎng)ESC，隨機分為CK1ε阻斷組(利用siRNA封閉ESC的CK1ε基因，然后給予SP刺激)，SP組(不封閉基因，直接給予SP刺激)，對照組(不作任何干預(yù)處理)。SP刺激后定量PCR和

17、Westernblot檢測β-catenin基因和蛋白表達(dá)水平，從而探討CK1ε在SP調(diào)控β-catenin表達(dá)中的作用。結(jié)果顯示：單純SP組β-catenin基因表達(dá)在刺激后0.5h就出現(xiàn)顯著上調(diào)，14h達(dá)到峰值1.059×106copy/μl，CK1ε阻斷組在SP刺激后0.5hβ-catenin表達(dá)輕度上調(diào)，14h達(dá)到最高值為0.342×106copy/μl，但是顯著低于SP組(P＜0.01)。SP組β-catenin蛋白表達(dá)刺激后