P物質調控表皮干細胞β-catenin表達的機制及其在ESC分化中的作用研究.pdf

1、表皮干細胞(EpidermalStemCells，ESC)是皮膚發(fā)育、代謝以及損傷修復的重要細胞源泉，它不僅決定了表皮的形成和代謝，同時參與了毛囊的形態(tài)發(fā)生、生理周期的維持，以及損傷毛囊的修復。探討ESC分化機制有助于尋找提高皮膚愈合速度與質量的措施，促進創(chuàng)傷愈合、提高創(chuàng)傷愈合質量。 以往研究證實，ESC中的β-catenin是啟動ESC分化進程與分化方向的關鍵蛋白。β-catenin是Wnt信號通路一種重要的胞內糖蛋白，低水平

2、β-catenin是ESC保持干細胞狀態(tài)的必要條件之一，當其表達上調后，ESC進入分化進程[6，7，8，9]，β-catenin高水平表達的ESC向毛囊方向分化，若去除β-catenin則向表皮細胞方向分化[10，11,12,13]。了解調控β-catenin表達的機制對探討主導ESC的分化方向，促進毛囊的修復與重建的措施，以及開展皮膚組織工程中的毛囊重建均有重要意義。 感覺神經(jīng)肽P物質(substancep，SP)作為一種研究

3、多年的細胞因子，以往對于它的研究主要集中于作為神經(jīng)遞質、激素和調質發(fā)揮的作用[14]。創(chuàng)傷時不僅感覺神經(jīng)末梢釋放SP，同時在組織修復過程中，成纖維細胞、內皮細胞等修復細胞在神經(jīng)末梢釋放的SP的誘導下，上調SP基因及蛋白的表達，作為自分泌信號促進成纖維細胞、內皮細胞的增殖，并誘導多種參與愈合的其他細胞因子及蛋白(EGF、bFGF、β-catenin、VEGF、MMPs、NF-κB和fibronectin等)表達上調。 尤其值得注意

4、的是，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SP是誘導ESC分化和遷移的重要細胞因子。臨床研究也注意到，SP與ESC參與構建的毛囊的形態(tài)發(fā)育關系密切。皮膚注射SP可以誘導萎縮的毛囊再生；耗竭成鼠SP，毛囊會萎縮并消失?；赟P和β-catenin在ESC分化方向調控中的作用，提示SP可能通過調控β-catenin表達實現(xiàn)細胞外信號到細胞內信號的轉導，進而調控ESC分化方向。CK1ε是β-catenin上游調控蛋白，與Wnt信號通路的GSK3協(xié)同控制β-

5、catenin的Sr45的磷酸化，從而調控β-catenin表達；SP與特異性受體NK-R結合，水解4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)生成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DG)雙信使，而PIP2對CK1ε表達具有負向調節(jié)作用?；谝陨弦罁?jù)，我們推論：1.SP通過調節(jié)β-catenin表達實現(xiàn)對ESC分化的調控；2).SP對β-catenin的調節(jié)通過調控CK1ε表達來實現(xiàn)。 為了驗證上述假設，本研究采用ESC培養(yǎng)

6、的離體細胞模型，利用定量PCR、Westernblot、siRNA基因干擾、流式細胞檢測等技術，從蛋白質、基因表達的不同層次，觀察了SP對ESCβ-catenin表達的調控作用，并從受體信號通路、ESC表達SP的自分泌信號機制、CK1ε在介導SP調控β-catenin中的作用等方面探討SP在調控ESC分化中的機制。 主要結果和結論如下： 第一部分SP對β-catenin表達的調控作用 培養(yǎng)的ESC給予10-7M的

7、SP刺激后，利用實時熒光定量PCR(RQ-PCR)和Westernblot技術檢測ESCβ-catenin基因和蛋白表達的變化。結果發(fā)現(xiàn)，SP刺激后0.5h，ESCβ-catenin基因與蛋白表達均上調；刺激后10～14h，β-catenin表達達到峰值，與對照組的表達相比較差異非常顯著。結論：SP是誘導ESCβ-catenin表達上調的重要細胞因子。 第二部分SP調控β-catenin表達的機制 實驗一NK受體在調控β

8、-catenin表達中的作用 使用特異性受體阻斷劑同時阻斷SP的NK1受體、NK2受體，以及分別阻斷兩種受體后，給予10-7MSP刺激，采用RQ-PCR和Westernblot檢測β-catenin基因及蛋白表達。結果發(fā)現(xiàn)，同時阻斷NK1受體和NK2受體后，雖給予SP刺激，但是ESCβ-catenin表達無明顯變化(P＜0.05)，提示SP主要通過NK1和NK2受體調控β-catenin的表達。分別阻斷NK1受體和NK2受體后發(fā)

9、現(xiàn)：阻斷NK1受體后給予SP刺激，β-catenin基因表達在0.5h就上升到0.279×106copy/μl，與對照組的0.151×106copy/μl差異顯著(P＜0.05)，14h后其表達上升到峰值0.829×106copy/μl，與對照組相比差異非常顯著(P＜0.01)；阻斷NK2受體后給予SP刺激，0.5h后β-catenin基因表達上升到0.193×106copy/μl，14h也達峰值，為0.428×106copy/μl。檢

10、測蛋白表達示：阻斷NK1給予SP刺激后3h，β-catenin蛋白表達平均光強度值上升到18.62ODU/mm2，24h后達到峰值(46.55ODU/mm2)，與對照組相比差異非常顯著(P＜0.01)：阻斷NK2受體給予SP刺激后3h，蛋白表達為15.26ODU/mm2，與對照組相比差異不顯著，24h達峰值25.59ODU/mm2，與對照間相比差異顯著(P＜0.05)。比較阻斷NK1受體和NK2受體后，β-catenin基因以及蛋白表達

11、水平，SP刺激10h后，二組差異顯著(P＜0.05)，24h差異非常顯著(P＜0.01)。 上述結果提示，SP通過NK1受體和NK2受體調控β-catenin表達，其中NK2-R發(fā)揮主要作用。 實驗二SP自分泌在β-catenin表達調控中的作用研究 1、表皮干細胞SP表達的研究 現(xiàn)將細胞隨機分為NK受體阻斷組(NK-R阻斷劑阻斷)、SP基因阻斷組(siRNA阻斷SP基因)、單純SP組、對照組，前三組分別

12、給予10-7MSP刺激。采用定量PCR和Westernblot技術分別檢測上述四組SP基因和蛋白的表達。結果發(fā)現(xiàn)：SP刺激后ESC的SP基因和蛋白表達均顯著上調，基因表達在刺激后6～10h時達到峰值1.73×107copy/μl，蛋白表達則在刺激后18h最高，為59.17ODU/mm2，兩者與對照組比較均有非常顯著差異(P＜0.01)；阻斷NK-R和SP基因后，雖給與SP刺激，SP基因和蛋白表達也無明顯上調。從而提示胞外SP與受體結合可

13、以誘導ESCSP表達上調。 2、SP自分泌在β-catenin表達調控中的作用研究 采用siRNA基因干擾技術封閉表皮干細胞SP基因的表達，而后給與10-7MSP刺激，再以定量PCR和Westernblot技術分別檢測ESCβ-catenin基因與蛋白的表達。結果顯示：當封閉SP基因后給予SP刺激，無論β-catenin基因還是蛋白，表達均只有輕度上調，與SP組表達相比有非常顯著差異(P＜0.01)。 上述結果提

14、示，ESC表達的SP是作為自分泌信號，在調控β-catenin表達中發(fā)揮重要作用。 實驗三CK1ε在SP調控β-catenin表達過程中的作用地位 1、SP對于CK1ε表達的調控作用及其特點 將培養(yǎng)的ESC隨機分為NK受體阻斷組，SP基因阻斷組，SP組，對照組(見實驗二)。采用定量PCR和Westernblot分別檢測CK1ε基因與蛋白表達水平，借以探討SP對于CK1ε表達的調控作用特點。結果發(fā)現(xiàn)：SP組細胞CK

15、1ε基因表達在SP刺激后0.5h，上升為0.854×106copy/μl，隨后繼續(xù)上升，刺激后14h達到最高點1.97×106copy/μl，與對照組相比差異非常顯著(P＜0.01)；NK受體阻斷組和SP阻斷組基因表達在刺激后均有輕度上升，但是顯著低于單純SP組表達(P＜0.01)。單純SP組細胞CK1ε蛋白表達刺激后24h時上升到最高點62.84ODU/mm2，顯著高于對照組(P＜0.01)；NK-R阻斷組和SP阻斷組蛋白表達在刺激后

16、均輕度上調，后者略高于前者，二者之間無統(tǒng)計學差異，但是這二者均顯著低于單純SP組表達(P＜0.01)。 上述結果提示ESC自表達的SP可作為自分泌信號調控CK1ε的表達。 2、SP通過CK1ε調控β-catenin表達的實驗研究 培養(yǎng)ESC，隨機分為CK1ε阻斷組(利用siRNA封閉ESC的CK1ε基因，然后給予SP刺激)，SP組(不封閉基因，直接給予SP刺激)，對照組(不作任何干預處理)。SP刺激后定量PCR和

17、Westernblot檢測β-catenin基因和蛋白表達水平，從而探討CK1ε在SP調控β-catenin表達中的作用。結果顯示：單純SP組β-catenin基因表達在刺激后0.5h就出現(xiàn)顯著上調，14h達到峰值1.059×106copy/μl，CK1ε阻斷組在SP刺激后0.5hβ-catenin表達輕度上調，14h達到最高值為0.342×106copy/μl，但是顯著低于SP組(P＜0.01)。SP組β-catenin蛋白表達刺激后