載脂蛋白M在血糖調(diào)控中的應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制及作用.pdf

1、第一部分，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人載脂蛋白M基因表達(dá)的方法
　　目的：建立檢測(cè)人載脂蛋白M（Apolipoprotein M, ApoM）的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。
　　方法：采用Primer Express Versions2.0設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針，檢測(cè)ApoM基因的表達(dá)。將擴(kuò)增的ApoM基因片段純化后與pMD19-T載體連接，克隆構(gòu)建含ApoM基因片段的重組質(zhì)粒，作為定量檢測(cè)ApoM基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)品。
　　

2、結(jié)果：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)為 ApoM特異性片段。本法靈敏度為40copies/μl，線性范圍為4.00×101～4.00×108 copies/μl，相關(guān)系數(shù)為1.000，擴(kuò)增效率E為90.5%，批間變異系數(shù)為6.38%～17.9%。
　　結(jié)論：成功建立了檢測(cè)人ApoM基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，且該方法特異性好，靈敏度高。
　　第二部分，游離脂肪酸下調(diào)載脂蛋白M表達(dá)
　　目的：由于胰島素抵抗的病人表現(xiàn)

3、為糖代謝異常，并且血漿游離脂肪酸（Free fatty acid, FFA）水平明顯升高，因此，本部分的研究目的是明確FFA水平升高是否影響ApoM的表達(dá)。
　　方法：用不同濃度棕櫚酸處理人肝癌細(xì)胞株（HepG2細(xì)胞）以及經(jīng)頸靜脈或尾靜脈給大鼠輸注脂肪乳，采用Real-time PCR及PCR芯片分析FFA對(duì)ApoM表達(dá)的影響和可能的機(jī)制。
　　結(jié)果：大鼠輸注20%脂肪乳6h后，血漿FFA水平升高到對(duì)照組的17.6倍（P<0

4、.01），葡萄糖輸注率（Glucose infusion rate，GIR）下降了27%（P<0.001），大鼠肝臟ApoM mRNA水平明顯下調(diào)（P<0.05）。單因素方差分析表明，0、0.25、0.5及1mM棕櫚酸分別作用HepG2細(xì)胞后，組間ApoM mRNA表達(dá)水平有顯著差異（P<0.01），1mM組與0mM相比，ApoM mRNA表達(dá)水平顯著下降（P<0.01）。PCR芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，1mM棕櫚酸組三磷酸肌醇激酶（Phosp

5、hatidylinositol3-kinase，PI-3K）途徑的主要組分及靶基因、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）途徑的主要組分及靶基因、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, Pparg）及其靶基因、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1靶基因以及與細(xì)胞周期、增殖相關(guān)基因的表達(dá)明顯高于對(duì)照組；大

6、鼠肝臟 PCR芯片的檢測(cè)結(jié)果也表明，輸注脂肪乳后，以上幾個(gè)信號(hào)途徑的基因或靶基因的表達(dá)水平也顯著升高。
　　結(jié)論：FFA可能通過PI-3K和/或PPARβ/δ信號(hào)途徑調(diào)節(jié)ApoM的表達(dá)，詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
　　第三部分，高濃度葡萄糖不通過游離脂肪酸途徑下調(diào)載脂蛋白M
　　目的：明確短時(shí)輸注高濃度葡萄糖是否通過游離脂肪酸途徑下調(diào)載脂蛋白M。
　　方法：經(jīng)頸靜脈或尾靜脈給大鼠輸注葡萄糖和/或羅格列酮（胰島素增敏

7、劑）；改良比色法檢測(cè)FFA水平；HEC試驗(yàn)測(cè)定GIR；Real-time PCR檢測(cè)ApoM mRNA水平。
　　結(jié)果：大鼠尾靜脈輸注25%葡萄糖后，血漿FFA濃度顯著低于輸注5%葡萄糖組（P<0.001）。羅格列酮對(duì)健康大鼠血漿FFA濃度的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。雙因素方差分析（Two-Way ANOVA）表明羅格列酮和高濃度葡萄糖對(duì)大鼠血漿FFA影響的交互作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。葡萄糖和羅格列酮對(duì)GIR均有

8、影響（P分別<0.0001），并且兩者的交互作用具有顯著意義（P<0.0001）。25%葡萄糖下調(diào)大鼠肝臟ApoM mRNA表達(dá)（P<0.05），而羅格列酮明顯增高大鼠肝臟ApoM mRNA的表達(dá)（P<0.0001），但兩者的交互作用不具有顯著意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：高濃度葡萄糖和羅格列酮對(duì)ApoM的調(diào)節(jié)作用是相對(duì)獨(dú)立的，且都不通過FFA途徑影響ApoM mRNA的表達(dá)。具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　第四部分，游離

9、脂肪酸及高濃度葡萄糖降低載脂蛋白M的機(jī)制
　　目的：初步明確FFA及高濃度葡萄糖降低ApoM的機(jī)制。
　　方法：分別用棕櫚酸（1mM）和/或PI-3K抑制劑LY294002（LY,10μM）、棕櫚酸（1mM）和/或蛋白激酶C抑制劑GF109203X（GFX,2μM）以及棕櫚酸（1mM）和/或PPARβ/δ的拮抗劑GSK3787（10μM）處理HepG2細(xì)胞；經(jīng)尾靜脈給大鼠輸注脂肪乳、葡萄糖和/或羅格列酮；Real-time

10、PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果：棕櫚酸顯著降低 HepG2細(xì)胞ApoM mRNA水平（P<0.01），PI-3K抑制劑LY對(duì)HepG2細(xì)胞ApoM mRNA表達(dá)的影響沒有顯著差異（P>0.05）；雙因素方差分析（Two-Way ANOVA）表明棕櫚酸和LY對(duì)HepG2細(xì)胞ApoM mRNA影響的交互作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GFX明顯降低ApoM mRNA的表達(dá)水平（P<0.05），但GFX不影響棕櫚酸降低ApoM mRNA的效應(yīng)

11、。1mM棕櫚酸顯著升高 HepG2細(xì)胞 PPARβ/δ mRNA水平（P<0.001）；PPARβ/δ的拮抗劑GSK3787對(duì)ApoM mRNA表達(dá)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；但能夠顯著抑制棕櫚酸降低HepG2細(xì)胞 ApoM mRNA的效應(yīng)。雙因素方差分析表明棕櫚酸和GSK3787對(duì)HepG2細(xì)胞ApoM mRNA影響的交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。25%葡萄糖顯著抑制大鼠肝臟LXRβ（P<0.001）、SHP1（P<

12、0.0001）、LRH1（P<0.01）、ABCA1（P<0.01）、PPARβ/δ（P<0.01）基因的表達(dá)；而羅格列酮僅降低SHP1（P<0.01）及ABCA1（P<0.05）基因的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮顯著抑制正常大鼠肝臟ABCA1 mRNA的表達(dá)（P<0.05）；但在高血糖狀態(tài)下，羅格列酮?jiǎng)t明顯升高大鼠肝臟ABCA1 mRNA水平（P<0.01）。雙因素方差分析表明羅格列酮和25%葡萄糖對(duì)大鼠肝臟ABCA1 mRNA影響的

13、交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　　結(jié)論：棕櫚酸通過PPARβ/δ途徑下調(diào)HepG2細(xì)胞ApoM基因表達(dá)。高濃度葡萄糖有可能主要通過LRH1和/或ABCA1途徑下調(diào)ApoM基因的表達(dá)。
　　第五部分，過表達(dá)人載脂蛋白M基因?qū)σ葝u素敏感性的影響
　　目的：探索過表達(dá)人 ApoM基因是否改善胰島素敏感性。
　　方法：利用慢病毒（Lentivirus）為轉(zhuǎn)基因載體，將人ApoM基因轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞和Goto

14、-Kakizaki（GK）大鼠。PCR芯片分析2型糖尿病相關(guān)基因，Real-time PCR檢測(cè)ApoM mRNA水平，胰島素耐量試驗(yàn)評(píng)價(jià)胰島素敏感性。
　　結(jié)果：293T細(xì)胞過表達(dá)ApoM后，ApoM mRNA水平與ApoM陰性慢病毒組相比增加了79.43倍（P<0.001）；同時(shí)，與胰島素抵抗相關(guān)的基因MAPK8下調(diào)了2.11倍（P<0.05）；GK大鼠經(jīng)尾靜脈注射5×108TU攜帶人ApoM基因的慢病毒后，肺組織中人ApoM