載脂蛋白嵌合模擬肽對(duì)巨噬細(xì)胞脂代謝和炎癥反應(yīng)的調(diào)控及機(jī)制探討.pdf

1、背景：
　　 巨噬細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展中最主要的細(xì)胞類型,與脂質(zhì)沉積及炎癥密切相關(guān)。循環(huán)中單核細(xì)胞募集至內(nèi)皮下是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的最早期事件。單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞,吞噬大量含載脂蛋白B(apoB)且富含膽固醇的脂蛋白顆粒。在動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段,大部分被吞噬的膽固醇以膽固醇-脂肪酸酯的形式儲(chǔ)存,導(dǎo)致了巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成。當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)一步進(jìn)展,出現(xiàn)膽固醇酯含量的逐步下降,以及相應(yīng)的非酯化的游離膽固

2、醇(free cholesterol,FC)含量的進(jìn)行性增加。FC在細(xì)胞的大量蓄積,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡和繼發(fā)性壞死,繼而引起病變壞死、斑塊破裂、血栓形成,最終導(dǎo)致臨床急性心血管事件發(fā)生。同時(shí)越來(lái)越多研究者發(fā)現(xiàn),在FC誘導(dǎo)凋亡發(fā)生前所觸發(fā)的炎癥反應(yīng)是影響斑塊穩(wěn)定性、造成動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展的另一重要因素。
　　 AS所致缺血性心臟疾病是中、老年人群發(fā)病和死亡的常見(jiàn)原因,探索能有效防治AS的措施一直是心血管疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。AS是一

3、種多因素疾病,體內(nèi)多種因子均不同作用地參與其發(fā)生發(fā)展,其中,載脂蛋白A-I(apoA-I)和載脂蛋白E(apoE)被認(rèn)為是該疾病的兩個(gè)保護(hù)性因子,二者均能通過(guò)多種途徑拮抗AS,且相互存在協(xié)同效應(yīng)。通過(guò)重組apoA-I和apoE全蛋白質(zhì)(holoprotein)雖然能夠治療AS,但因二者均為大分子蛋白(分子量分別為28kD和34kD),故只能通過(guò)靜脈給藥,且制備不易、成本高昂,限制了其臨床應(yīng)用。因此,通過(guò)研制分子量更小而功能上相當(dāng)?shù)腶po

4、A-I模擬肽和apoE模擬肽用以治療AS及其相關(guān)性疾病,被認(rèn)為是防治AS方面很有前景的新策略,且已取得了較大進(jìn)展。然而,現(xiàn)有apoA-I模擬肽和apoE模擬肽在抗AS方面均存在各自的不足,這在一定程度上降低了二者的治療效應(yīng)。于是有研究者利用天然apoA-I與apoE功能上的互補(bǔ)性,將apoE受體結(jié)合域與含有兩性螺旋結(jié)構(gòu)的apoA-I模擬肽共價(jià)結(jié)合,形成一種新型的具有雙結(jié)構(gòu)域的載脂蛋白嵌合模擬肽即Ac-He-18A-NH2。研究發(fā)現(xiàn)這種雙

5、結(jié)構(gòu)域的嵌合模擬肽可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞、HepG2細(xì)胞對(duì)低密度脂蛋白(LDL)的攝取、吸收和降解。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Ac-He-18A-NH2模擬肽在體內(nèi)具有抗炎及抗氧化的特性。在apoE基因敲除小鼠模型,靜脈注射該模擬肽,血漿膽固醇水平明顯下降。高膽固醇血癥兔靜脈注射Ac-He-18A-NH2后,不僅顯著降低了血漿膽固醇水平,而且通過(guò)降低血漿中過(guò)氧化氫脂質(zhì)、增加高密度脂蛋白(HDL)對(duì)氧磷酶濃度、誘導(dǎo)超氧陰離子形成從而對(duì)抗氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮

6、功能,從而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。
　　 目的：
　　 觀察載脂蛋白嵌合模擬肽Ac-He-18A-NH2對(duì)氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激下RAW264.7巨噬細(xì)胞膽固醇流出、凋亡及炎癥介質(zhì)釋放的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法v
　　 RAW264.7巨噬細(xì)胞傳代后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板,分為三組:(1)膽固醇流出檢測(cè)組:細(xì)胞種植于24孔板,用0.5μCi/孔3H-膽固醇和含50μg/ml oxL

7、DL共同孵育24小時(shí)之后,給予不同濃度的Ac-He-18A-NH2(0-100μg/ml)干預(yù)24h,收集細(xì)胞用液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)膽固醇流出。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(Camp)含量,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)、肝x受體α(LXRα)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的Mrna及蛋白表達(dá);(2)凋亡檢測(cè)組:細(xì)胞種植于6孔板,50μg

8、/ml oxLDL處理RAW264.7細(xì)胞48小時(shí)后加入不同濃度的模擬肽Ac-He-18A-NH2(1、10、50、100μg/ml)和膽固醇流出促進(jìn)劑β-環(huán)糊精(β-CD)或膽固醇流出阻斷劑布雷菲得菌素(BFA)共同孵育24小時(shí)。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡;分別通過(guò)試劑盒檢測(cè)caspase-3活性及細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量;Western-blot檢測(cè)細(xì)胞bcl-2蛋白的表達(dá);(3)炎癥反應(yīng)組

9、:oxLDL刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞,給予不同濃度的模擬肽Ac-He-18A-NH2(1-100μg/ml)干預(yù),收集細(xì)胞,測(cè)定TNF-α分泌和Mrna表達(dá)水平。Western-blot檢測(cè)ABCA1及P-IκB蛋白濃度。EMSA檢測(cè)核因子-Κb(NF-Κb)活性。
　　 結(jié)果v
　　 1.模擬肽Ac-He-18A-NH2以濃度依賴及時(shí)間依賴方式促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出。1、10、50、100μg/ml Ac-He-

10、18A-NH2干預(yù)24小時(shí)后,其介導(dǎo)的膽固醇流出率分別為12.04±1.65％、16.19±1.45％、26.93±4.37％和24.58±2.43％;50μg/mlAc-He-18A-NH2干預(yù)細(xì)胞不同時(shí)間,其介導(dǎo)的膽固醇流出率分別為10.86±1.46％(6 h),13.43±1.55％(12 h),20.58±1.34％(18 h),和26.93±4.37％(24 h)。
　　 2.Ac-He-18A-NH2以濃度依賴方式

11、增加細(xì)胞內(nèi)Camp水平,上調(diào)ABCA1、LXRα和PPARγmRNA和蛋白表達(dá)。
　　 3.加用Camp刺激劑8-Br-Camp,Ac-He-18A-NH2介導(dǎo)的膽固醇流出率明顯增加(26.93±4.37,35.81±2.73;P<0.05),ABCA1mRNA表達(dá)增加了66.67％。而加用PPARγ特異性抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后,PPARγ的表達(dá)幾乎完全抑制,ABCA1和LXRα的表達(dá)也受到一定程度抑制,Ac-He-18A-NH2介

12、導(dǎo)的膽固醇流出率明顯減少(26.93±4.37,17.23±1.93;P<0.01)。
　　 4.OxLDL誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的凋亡率隨著oxLDL濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提高。
　　 5.50μg/ml oxLDL處理細(xì)胞48小時(shí)后,加入不同濃度的模擬肽Ac-He-18A-NH2(1、10、50、100μg/ml)干預(yù),細(xì)胞凋亡率以濃度依賴的方式逐漸減少。
　　 6.模擬肽Ac-He-18A

13、-NH2呈濃度依賴性的促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出和降低細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量,降低caspase-3的活性,上調(diào)bcl-2的蛋白表達(dá)。
　　 7.β-CD與Ac-He-18A-NH2共同作用后膽固醇流出明顯增加,細(xì)胞凋亡率相應(yīng)減少。而通過(guò)BFA部分阻斷介導(dǎo)的膽固醇流出,細(xì)胞凋亡率明顯增加。
　　 8.OxLDL刺激使RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-α分泌和Mrna表達(dá)明顯增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積,促進(jìn)IκB磷酸化,并激活NF-Κb。

14、
　　 9.Ac-He-18A-NH2濃度依賴性降低TNF-α分泌及Mrna表達(dá),上調(diào)ABCA1Mrna和蛋白的表達(dá),減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量,抑制NF-Κb活化,并抑制IκB磷酸化。相同的實(shí)驗(yàn)條件下及作用濃度,D-4F對(duì)于TNF-α分泌的抑制作用不如Ac-He-18A-NH2。
　　 10.與oxLDL刺激組比較,50μg/ml Ac-He-18A-NH2使上清TNF-α濃度降低56％,其Mrna表達(dá)降低67％,細(xì)胞內(nèi)膽固

15、醇含量降低65％,ABCA1 Mrna和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào),NF-Κb活性減少65.34％,胞漿中IκB-α蛋白水平明顯升高,而p-IκB-α僅蛋白水平明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.模擬肽Ac-He-18A-NH2可以明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出,其機(jī)制可能與Camp-ABCA1和PPARγ-LXRα-ABCA1兩種途徑有關(guān)。
　　 2.模擬肽Ac-He-18A-NH2可以明顯抑制oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固