大鼠連合下器Nestin、Sox2及BrdU陽性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察.pdf

1、目的:觀察連合下器Nestin、Sox2及BrdU陽性細(xì)胞形態(tài)特征及意義。
　　 方法:選擇SD大鼠32只，清潔級，雌雄不限，6-8周齡，體重200g±20g，將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為兩組:①對照組(n=17):不作任何處理;②用藥組(n=15):連續(xù)三天腹腔注射BrdU，每天兩次，分別于16:00和18:00各一次，時間間隔為2小時。
　　 1、標(biāo)本取材。
　　 (1)正常動物模型標(biāo)本取材:將SD大鼠17只，在水合氯

2、醛(0.3ml/100g)麻醉下，經(jīng)由升主動脈灌注4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，PH7.2)進(jìn)行固定，立刻取腦，后固定。將組織標(biāo)本隨機(jī)分為兩組，選取含連合下器部分，一組進(jìn)行脫水，透明，包埋，石蠟切片機(jī)冠狀面切片，厚度為5μm。另一組進(jìn)行15％蔗糖溶液脫水，30％蔗糖溶液脫水，恒溫冰凍切片機(jī)冠狀面切片，厚度為10μm。
　　 (2) BrdU標(biāo)記動物模型標(biāo)本取材:SD大鼠15只，按照50mg/Kg對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行連續(xù)

3、三天BrdU生理鹽水溶液腹腔注射，每天兩次，間隔時間為2小時。第四日上午水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉后，經(jīng)由升主動脈灌注4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，PH7.2)固定，立刻取腦，后固定。將組織標(biāo)本隨機(jī)分為兩組，選取含連合下器部分，一組進(jìn)行脫水，透明，包埋，石蠟切片機(jī)冠狀面切片，厚度為5μm。另一組進(jìn)行15％蔗糖溶液脫水，30％蔗糖溶液脫水，恒溫冰凍切片機(jī)冠狀面切片，厚度為10μm。
　　 2、染色。

4、>　　 (1)甲苯胺藍(lán)染色:將上述標(biāo)本取材中獲得的石蠟切片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，中性樹膠封片后Olympus BX-UCB觀察照相。
　　 (2)免疫組織化學(xué)染色:將上述標(biāo)本取材中獲得的石蠟切片分別經(jīng)Nestin免疫組織化學(xué)染色、Sox2免疫組織化學(xué)染色和BrdU免疫組織化學(xué)染色后，使用中性樹膠封片之后Olympus BX-UCB觀察照相。
　　 (3)免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)染色:將上述標(biāo)本取材中獲得的冰凍切片分別經(jīng)Nesti

5、n+Sox2免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)染色、BrdU+Sox2免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)染色后，使用抗熒光衰減封片劑封固后，Olympus BX-UCB觀察照相。
　　 3、統(tǒng)計學(xué)處理。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果中所示陽性細(xì)胞采用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測定平均光密度值和大小。經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果觀察。
　　 冠狀面切片經(jīng)甲

6、苯胺藍(lán)染色后，通過光鏡觀察可見:SCO與第三腦室側(cè)壁室管膜分界鮮明，由兩層細(xì)胞構(gòu)成:一層是靠近室管膜的室管膜細(xì)胞層，染色較深，靠近腦室面（腹側(cè)）的一半無明顯細(xì)胞結(jié)構(gòu)，呈均質(zhì)狀，染色不均勻，血管少，另一半遠(yuǎn)離腦室面（背側(cè)），細(xì)胞輪廓界限清楚，整齊排列，染色較腹側(cè)側(cè)稍深，但在兩側(cè)面，各有一處染色略淺，形狀似貓耳狀，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，組織排列疏松，值得注意的是這兩個區(qū)域周圍血管豐富;另一層為其深面的室管膜下細(xì)胞層，染色較淺，與周圍腦組織細(xì)胞形態(tài)一

7、致，無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但可見纖維樣結(jié)構(gòu)。兩層細(xì)胞呈極性排列。第三腦室側(cè)壁的細(xì)胞間的界限清楚，排列整齊，由單層立方上皮細(xì)胞構(gòu)成，可以清晰分辨細(xì)胞輪廓，細(xì)胞表面光滑，核大小不等，呈現(xiàn)圓形或橢圓形。SCO內(nèi)有毛細(xì)血管的分布，數(shù)量較周圍腦區(qū)略多，靠邊緣部居多。
　　 2、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果觀察。
　　 2.1、Nestin: nestin免疫陽性細(xì)胞密集分布于SCO區(qū)域，與周圍腦區(qū)界限明顯。nestin陽性細(xì)胞的胞體多分布于SCO的

8、兩側(cè)部，中央部少見，免疫陽性細(xì)胞走行方向不同，可見著色密集區(qū)，兩側(cè)對稱分布，似貓耳狀，并且周圍有一個血管走行。室管膜下細(xì)胞層和其他腦區(qū)中可見散在分布。nestin免疫陽性產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞質(zhì)及其突起。通過冠狀面切片觀察，細(xì)胞染色較強(qiáng)，數(shù)量較多，陽性細(xì)胞形態(tài)多表現(xiàn)為各種星狀或放射狀突起，陽性細(xì)胞在側(cè)腦室和脈絡(luò)叢切片可觀察到。細(xì)胞的突起一方面由腹側(cè)向背側(cè)走向，從第三腦室頂部穿過SCO和后連合向背側(cè)軟腦膜放射，終止于軟腦膜;另一部分突起較密集

9、向腹側(cè)發(fā)出，多見于室管膜細(xì)胞層腹側(cè)的均質(zhì)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，兩側(cè)向中央集中。SCO室管膜細(xì)胞層Nestin免疫陽性細(xì)胞的平均光密度值為0.0357±0.0013，室管膜下細(xì)胞層Nestin免疫陽性細(xì)胞的平均光密度值為0.0098±0.0019。SCO室管膜細(xì)胞層與室管膜下細(xì)胞層比較結(jié)果顯示有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 2.2、Sox2:Sox2免疫陽性細(xì)胞在SCO區(qū)域彌散分布，染色較強(qiáng)，數(shù)量較多，所染陽性細(xì)胞核多呈現(xiàn)圓形或橢圓形，

10、在室管膜層腹側(cè)的一半無陽性表達(dá)，室管膜下細(xì)胞層陽性細(xì)胞在兩側(cè)部少，第三腦室側(cè)壁細(xì)胞呈單層排列，其他區(qū)域可見散在分布。Sox2免疫陽性產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞核。陽性細(xì)胞于側(cè)腦室室管膜處可見單層緊密排列。
　　 2.3、BrdU:本實(shí)驗(yàn)在冠狀切面上SCO內(nèi)零星分布BrdU免疫陽性細(xì)胞，位置不固定。
　　 3、免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果的觀察。
　　 3.1、BrdU、Sox2免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果觀察:通過冠狀面切片觀察，可見S

11、CO室管膜細(xì)胞層的背側(cè)Sox2免疫陽性細(xì)胞數(shù)量較多，呈對稱性分布，細(xì)胞核多呈現(xiàn)圓形或橢圓形。Sox2免疫陽性細(xì)胞在第三腦室側(cè)壁室管膜處呈單層排列，其他區(qū)域呈現(xiàn)散在分布。BrdU免疫熒光陽性細(xì)胞數(shù)量少，呈綠色。有少量細(xì)胞同時存在雙標(biāo)陽性表達(dá)。
　　 3.2、Nestin、Sox2免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果觀察:通過冠狀面切片觀察，可見nestin免疫陽性細(xì)胞主要位于SCO室管膜層腹側(cè)。第三腦室側(cè)壁未出現(xiàn)陽性表達(dá)，細(xì)胞突起表現(xiàn)為絲狀、絮狀

12、，由第三腦室頂部向背側(cè)放射。Sox2免疫陽性細(xì)胞在SCO的室管膜層背側(cè)集中分布，數(shù)量較多，所染陽性細(xì)胞核多呈現(xiàn)圓形或橢圓形，背側(cè)為小細(xì)胞兩側(cè)為大細(xì)胞。在SCO的室管膜細(xì)胞層集中分布，第三腦室側(cè)壁室管膜處呈單層排列，其他區(qū)域可見散在分布。有一部分細(xì)胞同時存在雙標(biāo)陽性表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1、Nestin免疫陽性細(xì)胞多分布于SCO的室管膜層外側(cè)部的大細(xì)胞，其突起較長，可向背側(cè)穿行后連合達(dá)軟膜下，向腹側(cè)穿行室管膜的均質(zhì)層