西伯利亞鱘的側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育形態(tài)學(xué)觀察及其相關(guān)基因Sox9,Sox2表達(dá)檢測.pdf

1、西伯利業(yè)鱘(Acipenser baerii)隸屬鱘形目（Acipenser iformes)，鱘科（Acipenser idae)，鱘屬（Acipense)，為軟骨硬鱗魚，分布于西伯利亞河流和湖泊，是地球上最為古老的物種和魚類之一，因而具極高的進(jìn)化研究價(jià)值。以往西伯利亞鱘的研究主要集中于育種，繁殖和生理生化水平。近年來，西伯利亞鱘胚胎及側(cè)線神經(jīng)發(fā)育分化被學(xué)者所關(guān)注。同大多數(shù)魚類一樣，西伯利亞鱘側(cè)線神經(jīng)的神經(jīng)丘位于其側(cè)線管內(nèi)，每一個(gè)神經(jīng)

2、丘聚集成百個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，包含有周圍和中樞神經(jīng)通路，有感覺水流、水壓、水溫、聽覺等機(jī)能。為了追蹤西伯利亞鱘側(cè)線神經(jīng)發(fā)育過程及其作用的相關(guān)基因，本文對(duì)此開展了初步研究，取得了以下結(jié)果：
　　 1、形態(tài)學(xué)研究方面：
　　 為揭示西伯利亞鱘側(cè)線管內(nèi)側(cè)線神經(jīng)丘形態(tài)結(jié)構(gòu)及胚后側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育過程，本研究對(duì)西伯利亞鱘(Acipenser baerii)成魚進(jìn)行石蠟切片并進(jìn)行HE染色，同時(shí)利用熒光染料DiA[4-(4-Diethylamin

3、ostyryl)-1-methylpyridinium iodide]對(duì)側(cè)線管內(nèi)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞特異性標(biāo)記的特點(diǎn)，示蹤了西伯利亞鱘胚后仔魚各時(shí)期側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育分化發(fā)育的過程。側(cè)線神經(jīng)丘組織學(xué)石蠟切片結(jié)果顯示：西伯利業(yè)鱘側(cè)線管內(nèi)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞如纖毛狀，呈豎立緊密排列。側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育熒光示蹤結(jié)果表明：出膜3天仔魚眼眶后神經(jīng)基板發(fā)育分化的活動(dòng)劇烈，出膜10天的仔魚眼眶后方的神經(jīng)基板分化出眼眶上下側(cè)線神經(jīng)丘的兩個(gè)分支，同時(shí)眼眶后神經(jīng)基板進(jìn)一步

4、向后分化發(fā)育在眼眶后部形成軀干側(cè)線神經(jīng)丘，但整個(gè)側(cè)線神經(jīng)丘還未完全發(fā)育完成，待出膜15天時(shí)，眼眶上下和軀干側(cè)線神經(jīng)丘已基本發(fā)育完全，出膜22天的仔魚側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育基本完成。
　　 2、分子生物學(xué)研究方面：
　　 a)為提高繪制西伯利亞鱘側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育相關(guān)基因Sox9和Sox2時(shí)空表達(dá)譜的可信度和精確度，根據(jù)已發(fā)表的魚類β-actin基因cDNA同源保守區(qū)，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)而結(jié)合RACE技術(shù)克隆了西伯利亞鱘β-actin基因c

5、DNA全長，序列分析表明西伯利亞鱘β-actin基因cDNA全長1322bp，其包括的137bp的5'端非翻譯區(qū)，57bp的3端非翻譯區(qū)和編碼375個(gè)氨基酸殘基的1125bp開放閱讀框。與其他物種進(jìn)行分子進(jìn)化分析表明，該基因具有極高的保守性，且與斑馬魚，黃顙魚的親緣關(guān)系較近。
　　 b)為揭示西伯利亞鱘Sox9基因在其側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育分化過程中的作用，根據(jù)已發(fā)表的魚類Sox9基因的HMG-box保守區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，結(jié)合同源克隆和

6、RACE方法獲得了西伯利亞鱘Sox9基因cDNA全長序列，經(jīng)序列分析表明，所克隆Sox9 cDNA全長1409bp，包括開放閱讀框(ORF)1082bp，5'UTR(非編碼區(qū))為20bp和3'UTR為307bp。1083bp ORF共編碼360個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為41221.7U.序列分析表明，其與施氏鱘的親緣關(guān)系較近，其次是斑馬魚。借助β-actin作為內(nèi)參基因，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)西伯利亞鱘Sox9在各組織以及在胚胎發(fā)育各時(shí)期當(dāng)

7、中的相對(duì)表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)具有明顯的組織差異性和時(shí)間差異性。其中，胰臟和肌肉組織中表達(dá)量相對(duì)較低，而腎，腦，肝中的表達(dá)量相對(duì)較高且差別不大，是胰臟和肌肉表達(dá)量的2.3倍和21倍。在胚胎發(fā)育的不同階段Sox9的表達(dá)量也有一定變化，在囊胚期、神經(jīng)胚期及心臟形成期，Sox9表達(dá)量相對(duì)較高，特別是囊胚期和神經(jīng)胚期，其表達(dá)量是原腸期的1.8倍和1.6倍。
　　 c）為深入探究西伯利亞鱘Sox2基因在其側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞分化再生過程

8、中的作用，借助已發(fā)表的魚類Sox基因的HMG-box保守區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，結(jié)合同源克隆技術(shù)獲得了西伯利亞鱘Sox2基因的同源保守區(qū)，得到一個(gè)長度為768bp的序列，該序列也具較高的保守性，經(jīng)分子進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該基因與其他物種的相似性也達(dá)到了70％以上。隨后，借助β-actin作為內(nèi)參基因，對(duì)Sox2基因在西伯利亞鱘成魚各組織及胚胎發(fā)育各時(shí)期進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)Sox2基因在不同的組織當(dāng)中均有表達(dá)。其中，在肝、胰、腎、腦四個(gè)組織

9、中表達(dá)量差距不大，均處于相對(duì)較低的水平，在肌肉組織當(dāng)中，表達(dá)量最高，達(dá)到了肝臟當(dāng)中的10.4倍。同時(shí)檢測表明，Sox2基因雖在西伯利亞鱘胚胎發(fā)育各時(shí)期均表達(dá)，但表達(dá)具明顯的時(shí)間差異性。在受精卵期、囊胚期Sox2基因的相對(duì)表達(dá)量較低，在原腸期、神經(jīng)胚期、視泡形成期和心臟形成期Sox2基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)較高，且在心臟形成期達(dá)到了最高點(diǎn)。
　　 本研究結(jié)果為今后深入研究西伯利亞鱘側(cè)線發(fā)育過程中的神經(jīng)分化發(fā)育、細(xì)胞遷移及其整個(gè)過程中特異性