IKKε在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與其促膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲的分子機(jī)制研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是最棘手的難治性腫瘤之一，盡管神經(jīng)外科手術(shù)、放療和化療的發(fā)展對膠質(zhì)瘤的治療起了重要的推動作用，但療效并不理想，預(yù)后仍然不良[1]。尤其是惡性膠質(zhì)瘤(GBM)，因其高增殖及侵襲性生物學(xué)特性，雖經(jīng)以手術(shù)為主聯(lián)合放射及化學(xué)治療，但預(yù)后并沒有得到明顯改善。平均存活時(shí)間只有12-15個(gè)月[2]，其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme，GBM)患者，尤其是老年患者，生存期不足1年[3]。如何控制膠質(zhì)瘤的惡性增殖和

2、侵襲是目前研究的焦點(diǎn)。目前已認(rèn)識到，膠質(zhì)瘤是一種多基因異常疾病，分子發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞信號通路中細(xì)胞因子的異常表達(dá)[4]。因此尋找導(dǎo)致膠質(zhì)瘤發(fā)病相關(guān)的基因，深入了解膠質(zhì)瘤的致病機(jī)理，進(jìn)一步開拓膠質(zhì)瘤治療的新策略和靶點(diǎn)，成為膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要內(nèi)容。
　　近年來，RNA干擾技術(shù)迅速發(fā)展，為膠質(zhì)瘤靶標(biāo)研究提供了新思路。它不僅可以用于尋找與增殖、侵襲相關(guān)的靶標(biāo)，更可以作為潛在的治療手段，為膠質(zhì)瘤靶向治療提供強(qiáng)有力干預(yù)治療。I

3、KK/NF-KB通路是一個(gè)重要的癌細(xì)胞存活的信號通路[5]。該通路中NF-KB的激活涉及IKB(NF-KB抑制劑)的磷酸化，而后者有賴于IKK(IKB激酶)的調(diào)控。IKB激酶家族(kinases，IKKs)作為NF-кB信號途徑的關(guān)鍵成員，能磷酸化IKB上的特定位點(diǎn)，從而使IкBα泛素化并最終被蛋白酶體降解，解除IKB對NF-KB的抑制。游離的NF-KB從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，激活參與應(yīng)激反應(yīng)和免疫細(xì)胞活化、增殖、分化、凋亡及腫瘤形成等相關(guān)

4、的400多種基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[6-8]。IKKε作為IKK家族新近發(fā)現(xiàn)的成員，在眾多腫瘤中被確認(rèn)高表達(dá)且在它們的惡性轉(zhuǎn)化中起著重要作用。并且多數(shù)研究已經(jīng)證實(shí)IKKε可以活化NF-KB通路是其致癌的重要機(jī)制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低IKKε對如乳腺癌[9]，卵巢癌[10]、前列腺癌[11]等細(xì)胞有顯著的抑癌作用，然而對IKKε在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)以及作用機(jī)制研究甚少。我們前期研究檢測了9個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(D32，D37，M067，H4，U138

5、，U251，U87，U373，TP483)、3例正常腦組織和10例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中IKKε表達(dá)，結(jié)果提示IKKε在大多數(shù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(僅TP483無IKKε表達(dá))和膠質(zhì)瘤標(biāo)本中過表達(dá)，而同時(shí)在正常腦組織(3例)中幾無表達(dá)。這些結(jié)果初步提示IKKε在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著類似于乳腺癌中癌基因的作用。我們認(rèn)為這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤分子病理的致病機(jī)制提供了重要的線索，因此有必要對膠質(zhì)瘤中IKKε/NF-KB通路在膠質(zhì)瘤增殖和侵襲中的作用進(jìn)行

6、進(jìn)一步研究。
　　本課題第一部分應(yīng)用RT-PCR的方法檢測51例膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本和7例正常腦組織以及7個(gè)細(xì)胞系IKKε的mRNA表達(dá)，應(yīng)用免疫組化方法和蛋白印跡方法檢測了IKKε基因在蛋白水平的表達(dá)。并研究IKKε表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度之間的相關(guān)性。
　　第二部分在體外應(yīng)用RNA干涉技術(shù)以oligofectamine介導(dǎo)siRNA靶向IKKε轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251和LN229細(xì)胞后，應(yīng)用realtime PCR和蛋白印跡檢

7、測目的基因和蛋白水平的敲低情況，采用細(xì)胞周期、MTT、細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測敲低IKKε后的細(xì)胞增殖能力；采用劃痕試驗(yàn)、侵襲試驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。應(yīng)用蛋白印跡和PCR分別檢測了NF-KB通路中涉及增殖、侵襲、凋亡有關(guān)的蛋白，應(yīng)用細(xì)胞免疫組化，細(xì)胞免疫熒光分別檢測了敲低IKKs后NF-KB的細(xì)胞轉(zhuǎn)座情況。分別提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)NF-KB組分P65應(yīng)用蛋白印跡進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染IKKε siRNA后NF-

8、KB的向細(xì)胞核轉(zhuǎn)座情況。
　　第三部分中則通過建立建立U251裸鼠皮下荷瘤模型，瘤內(nèi)注射oligofectamine和siRNA的混合物，每2天測量一次腫瘤體積，動態(tài)觀察腫瘤生長情況，檢測RNA干涉技術(shù)敲低U251裸鼠膠質(zhì)瘤IKKε的表達(dá)后NF-KB通路主要成員的表達(dá)變化，對體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。免疫組化法檢測腫瘤標(biāo)本的相關(guān)蛋白表達(dá)情況分析可能的抑癌機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.第一部分腫瘤標(biāo)本顯示40/51例IKK

9、ε有表達(dá)，Ⅲ/Ⅳ級中23/27例中/高表達(dá)。且和腫瘤級別呈正相關(guān)。同時(shí)還檢測到4/7細(xì)胞系中IKKε過表達(dá)。膠質(zhì)瘤IKKε表達(dá)強(qiáng)度隨腫瘤惡性程度增加而增加。
　　2.第二部分結(jié)果表明IKKε siRNA可有效敲低IKKε在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和LN229細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，細(xì)胞流式示細(xì)胞周期SPF下降，G0/G1阻滯，MTT法證實(shí)細(xì)胞增殖受抑制。且細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低；敲低IKKε后細(xì)胞中IкBα水平升高，NF-KB向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)

10、座明顯減少。然而，本實(shí)驗(yàn)顯示IKKε似乎和凋亡無顯著相關(guān)。
　　3.第三部分成功構(gòu)建裸鼠皮下膠質(zhì)瘤模型，IKKε siRNA組顯示腫瘤生長速度減慢，體積變小。免組化結(jié)果表明靶向IKKε siRNA組較無義siRNA組NF-KB通路下游增殖侵襲指標(biāo)的表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.IKKε在人腦膠質(zhì)瘤中過表達(dá)，和腫瘤病理分級正相關(guān)，可能參與膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。
　　2.IKKε促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展是通過IкB/NF-KB通