丙型肝炎病毒重組腺病毒疫苗rAd-E2及rAd-△E2的實驗研究.pdf

1、目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是一個全球性健康問題,迄今全球約有1.7-2.0億HCV感染者,目前仍無有效的防治方法。因此,開發(fā)有效的預防和治療性HCV疫苗,就成了一個亟待解決的問題。
　　 E2蛋白是HCV最重要的中和靶抗原,可誘導機體產(chǎn)生HCV的中和抗體,但因其能與人CD81分子結(jié)合,使B細胞激活的正常信號傳導通路發(fā)生變化,導致B淋巴細胞的異常激活和增殖紊亂,從而產(chǎn)生免疫抑制作用而可能不

2、適合用作疫苗的靶抗原?，F(xiàn)已證明HCV E2蛋白中與CD81分子結(jié)合的位點包括E2蛋白的481-491及544-551位氨基酸殘基,對這兩個位點進行突變使之不再結(jié)合人CD81分子而仍然保持其天然構(gòu)型和中和表位。故這種結(jié)構(gòu)優(yōu)化的HCV E2蛋白有望成為丙肝疫苗的有效靶抗原。
　　 腺病毒以其廣泛的宿主范圍、極高的轉(zhuǎn)染效率、高水平表達外源基因且誘導機體產(chǎn)生針對目的蛋白的免疫應答、上調(diào)抗原提呈細胞協(xié)同刺激因子的表達、無插入突變性等優(yōu)點,

3、成為極具應用前景的基因轉(zhuǎn)移載體。
　　 因此,本實驗利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建、包裝重組腺病毒rAd/E2、rAd/△E2(recombinant adenovirus E2、recombinant adenovirus△E2),并且對rAd/E2誘導的特異性免疫應答進行了研究,為丙型肝炎
　　 疫苗的研制探索新的途徑。
　　 方法:(1)目的基因的擴增與鑒定:以pEGFPd-HCV/E1E2為模板,擴增

4、E2目的基因。將擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌E.coliDH5α,提取質(zhì)粒進行PCR、酶切鑒定及測序,篩選重組子。(2)真核表達質(zhì)粒pcDNA3.0/E2的構(gòu)建:將鑒定正確的質(zhì)粒pGEM-T/E2用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切,膠回收目的片段,并與經(jīng)相同酶切的pcDNA3.0質(zhì)粒載體連接。經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、PCR和酶切鑒定,構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.0/E2。(3)突變質(zhì)粒pcDNA3.0/△E2的構(gòu)建:分別在HCV481-4

5、91及544-551位氨基酸殘基序列中隨機選擇預突變位點(486aa的半胱氨酸預突變?yōu)楸奖彼?544、545aa的脯氨酸分別預突變?yōu)榱涟彼?、丙氨?,各設計一對突變引物,然后分別以pcDNA3.0/E2為模板進行一步法PCR介導的突變反應,得到兩種獨立含有各自突變位點的突變質(zhì)粒pcDNA3.0/△E2①、pcDNA3.0/△E2②;然后再用下段序列的突變引物,以pcDNA3.0/△E2①為模板再次進行PCR突變反應,得到上下段序列同時

6、含有突變位點的質(zhì)粒pcDNA3.0/△E2③。(4)重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建:將pGEM-T/E2、pcDNA3.0/△E2用恰當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶雙酶切,回收純化目的片段,并與經(jīng)同樣酶切的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV連接,經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、PCR和酶切鑒定,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV/E2、pAdTrack-CMV/△E2。(5)重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建:將重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV/E2、pAdTrack-CMV/△

7、E2分別用內(nèi)切酶PmeⅠ線性化,利用AdEasy系統(tǒng),經(jīng)兩步法在大腸桿菌BJ5183中與骨架載體pAdEasy-1同源重組,構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd/E2、pAd/△E2。用PacⅠ酶切鑒定,將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α,挑取陽性克隆,以堿裂解法大量提取重組質(zhì)粒,并用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法進行純化。(6)重組腺病毒的包裝與擴增:將重組腺病毒質(zhì)粒pAd/E2、pAd/△E2分別用內(nèi)切

8、酶PacⅠ線性化,以陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細胞,并觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表達。凍融法收集初代病毒液。取初代病毒液感染293細胞,進行第二輪擴增,同法進行第三、四輪大量擴增,大量收集第四代病毒液,用腺病毒純化試劑盒進行純化。(7)重組腺病毒滴度測定:待293細胞在96孔板中生長至70-80％匯合時,以不同稀釋倍數(shù)的各代病毒液感染細胞,培養(yǎng)48h后,以GFP陽性細胞計數(shù)法測定

9、病毒滴度(病毒滴度=熒光細胞數(shù)×病毒液的稀釋倍數(shù)/病毒液量)。(8)用PCR、RT-PCR分別對重組腺病毒進行鑒定,同時用第三代重組腺病毒rAd/E2感染293細胞,24-48h后,收集細胞,Western blot法檢測HCV E2的表達。(9)同法擴增并純化本室前期構(gòu)建的Ad,并測定病毒滴度。(10)用堿裂解法從轉(zhuǎn)化的DH5α大腸桿菌中提取質(zhì)粒pcDNA3/E2,用聚乙二醇沉淀法進行純化。(11)動物實驗:將6-8周齡雄性BALB/

10、c小鼠隨機分為4組,分別為rAd/E2實驗組、pcDNA3.0/E2陽性對照組、Ad陰性對照組和PBS空白對照組。疫苗采用股四頭肌注射,其中rAd/E2組和Ad組每間隔2周免疫一次,共免疫兩次;pcDNA3.0/E2組和PBS組每間隔3周免疫一次,共免疫3次。末次免疫后3周,每組3只小鼠取脾臟制備淋巴細胞懸液,用細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)進行淋巴細胞增殖活性和特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytot

11、oxic T lymphocyte,CTL)殺傷活性的檢測。
　　 結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了質(zhì)粒pGEM-T/E2,限制性酶切鑒定及測序結(jié)果與預期值相符。(2)成功構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pcDNA3.0/E2及三種突變質(zhì)粒pcDNA3.0/△E2,其中pcDNA3.0/△E2①包含的預突變位點(486aa的半胱氨酸預突變?yōu)楸奖彼?位于HCV481-491aa序列中;pcDNA3.0/△E2②包含的預突變位點(544及545aa的脯氨

12、酸分別預突變?yōu)榱涟彼?、丙氨?位于HCV544-551aa序列中;pcDNA3.0/△E2③同時包含上述兩段序列中的突變位點。(3)成功構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV/E2、pAdTrack-CMV/△E2,PCR鑒定及限制酶切分析證明符合預期設計。(4)成功構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd/E2、pAd/△E2,用PacⅠ酶切均得到約30kb的大片段和一個4.5kb的小片段。(5)成功包裝并擴增純化重組腺病毒rAd/E2、rAd/△

13、E2。(6)重組腺病毒rAd/E2、rAd/△E2①-③初代至第四代病毒滴度分別為:2.2×104 pfu/ml、4.0×107pfu/ml、1.0×108 pfu/ml、7.5×108 pfu/ml;2.5×104 pfu/ml、1.0×107 pfu/ml、2.65×108 pfu/ml、6.0×108 pfu/ml;3.0×104 pfu/ml、4.1×107 pfu/ml、3.7×108 pfu/ml、9.5×108 pfu/m

14、l;1.8×104 pfu/ml、4.0×106 pfu/ml、6.7×107 pfu/ml、3.9×108 pfu/ml。(7)PCR對重組腺病毒rAd/E2、rAd/△E2病毒液鑒定;RT-PCR對第三代重組腺病毒rAd/E2、rAd/△E2感染的293細胞鑒定,1％瓊脂糖凝膠電泳均檢測到特異性目的條帶;三代rAd/E2病毒液感染293細胞24-48h后,提取細胞總蛋白,Western Blot檢測到細胞中有E2蛋白的表達。(8)小

15、鼠脾淋巴細胞增殖試驗分別以滅活的重組腺病毒rAd/E2病毒液和刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)體外刺激淋巴細胞,檢測細胞增殖活性。其中陽性對照ConA刺激時,各組均檢測到淋巴細胞非特異性增殖,以rAd/E2病毒液刺激時,各組未見到顯著的特異性淋巴細胞增殖。(9)小鼠脾臟特異性CTL殺傷活性經(jīng)單因素方差分析表明,以重組腺病毒感染的SP2/0作為靶細胞時,Ad/E2組、Ad組及pcDNA3.0/E2組均與PBS組有差別,