攜帶流行毒株E2基因的重組豬瘟病毒C株的拯救與鑒定.pdf

1、豬瘟(Classical swine fever,,CSF)是嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一,具有高傳染性和高致病性的特點。其病原為豬瘟病毒(CSFV),屬黃病毒科瘟病毒屬成員。CSFV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒,基因組長約12.3kb。囊膜糖蛋白E2具有良好的免疫原性,可誘導機體產(chǎn)生中和抗體并對強毒的攻擊提供保護。E2在病毒感染過程中也起著重要作用,與病毒吸附,侵入宿主細胞,細胞嗜性和毒力強弱有關(guān)。新近研究表明,在CSF流行地區(qū),其癥狀

2、呈現(xiàn)非典型化,甚至在免疫豬群中也有發(fā)??；CSFV流行毒株已經(jīng)從以前的group1轉(zhuǎn)向group2。有跡象表明我國目前使用的group1兔化弱毒C株疫苗對group2 CSFV流行毒株難以提供有效保護。本項目的是:(1)建立豬瘟病毒疫苗株和野毒株的鑒別RFLP技術(shù)體系；(2)分析我國浙江地區(qū)CSFV流行情況；(3)比較CSFV當前流行毒株與早期group1強毒株和兔化弱毒C株在體外生長特性、囊膜糖蛋白E2的分子變異特征與抗原多樣性方面的差

3、異；(4)應用反向遺傳學技術(shù),構(gòu)建基于兔化弱毒C株和攜帶目前流行毒株E2基因的重組病毒,為開發(fā)針對流行毒株的新型標記疫苗奠定基礎(chǔ)。1、豬瘟病毒疫苗株和野毒株的鑒別RFLP技術(shù)
　　 在CSFV-E2基因的上、下游保守區(qū)域分別設計兩對簡并引物用于套式RT-PCR檢測。結(jié)果表明,該體系具有很好的特異性和靈敏性,檢測下限為1400拷貝數(shù)的CSFV基因組。根據(jù)不同毒株E2基因中MspI酶切位點排布的不同,建立了鑒別檢測疫苗株和野毒株的R

4、FLP方法。應用此方法對2003-2008年浙江地區(qū)豬場采集的309份組織樣品進行CSFV檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)91份樣品能擴增出CSFV特異性條帶,陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)MspI酶切,22份樣品中含有疫苗株；60份為野毒感染,其余9份能同時檢出疫苗株與野毒株。選擇4種限制性內(nèi)切酶Bgll,DdeI,DraI和PstI分別對38株流行毒株的E2基因進行酶切,流行毒株可被分為11個不同的RFLP亞型。以上結(jié)果表明,浙江地區(qū)存在CSFV的流行,且流行毒株

5、在E2基因水平上存在較大差異。2、豬瘟病毒經(jīng)典強毒株和流行毒株在PK-15細胞和ST細胞中的生長特性比較
　　 比較了兩個流行毒株(QZ-07和HZ1-08)和石門株在PK-15和ST細胞中的生長特性。強毒石門株在PK-15細胞中的增殖效率明顯高于其在ST細胞。在感染PK-1548h后,滴度可達到107TCID50/ml,而在相同時間,在ST細胞中只能達到105.25TCID50/ml。而兩流行毒株在PK-15細胞中的增殖水平明

6、顯低于ST細胞,尤其以HZ1-08更為明顯。在ST細胞感染的48h后,HZ1-08的滴度可達到105TCID50/ml,而在PK-15細胞中滴度只有102.75TCID50/ml。IFA檢測結(jié)果同樣表明,在感染48小時后,石門株感染的PK-15細胞均為陽性,而HZ1-08只有零星幾個熒光斑。雖然三個毒株在感染不同階段,ST細胞內(nèi)病毒滴度基本一致,但石門株在增殖過程中釋放于上清中的病毒滴度明顯高于兩個流行毒株。細胞內(nèi)外感染性病毒粒子的比例

7、在一定程度上可以判斷病毒毒力的強弱,根據(jù)以上體外生長特性可以初步推斷兩個流行毒株不屬于強毒株。3、豬瘟病毒流行毒株的全基因組比較和基于E2基因的分子變異特征分析
　　 對弱毒C株、石門株和分離株QZ-07進行了全基因組測序,結(jié)合從GenBank中下載的22個CSFV的全基因組進行遺傳進化關(guān)系分析。結(jié)果表明,25個毒株可以分為兩個分支,C株和石門株處于一個分支,而QZ-07位于遺傳關(guān)系較遠的另一個分支。同義突變與非同義突變以及熵值

8、分析結(jié)果表明,CSFV多聚蛋白的前1/3編碼區(qū)(包括病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在內(nèi)的區(qū)域)比后2/3編碼與病毒RNA復制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域變異性大,3個結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)NS5A比較高變,而NS3、NS4B和NS5B相對保守。
　　 我們進一步對2004-2008年內(nèi)流行于浙江地區(qū)的34株CSFV囊膜糖蛋白E2的分子變異特征進行深入分析。結(jié)果表明,流行毒株屬于group2,除了2004年的一株病毒屬于subgroup2.2以外,其余毒株均屬

9、于subgroup2.1,且都歸于genotype2.1b。而目前使用的疫苗C株屬于group1中的subgroup1.1。全長E2的核苷酸和氨基酸序列比較結(jié)果表明,流行毒株之間核苷酸的同源性在94.6％-99.8％之間,氨基酸的同源性在94.9％-99.7％之間。與C株相比,核苷酸的同源性在81.6％-82.6％之間,氨基酸的同源性在87.4％-89.3％之間。同義突變與非同義突變以及熵值分析結(jié)果表明,在E2蛋白中,N端抗原區(qū)域的變異

10、程度大于C端,抗原區(qū)內(nèi)鑒定的2個高變區(qū)中與抗體相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點處于正選擇壓力,且流行毒株與疫苗株在這些位點上差異很大。4、豬瘟病毒C株E2蛋白單克隆抗體的研制與鑒定
　　 為了進一步探索E2蛋白N端高變區(qū)域內(nèi)與抗體識別相關(guān)的一些關(guān)鍵氨基酸位點差異對不同毒株抗原結(jié)構(gòu)的影響,我們以C株E2為抗原免疫BALB/c小鼠,應用雜交瘤技術(shù)結(jié)合IFA篩選,獲得了3株持續(xù)、穩(wěn)定分泌小鼠抗E2的單克隆抗體的雜交瘤細胞株1E7、286和68

11、8。免疫印跡和ELISA鑒定結(jié)果表明,只有286能與變性的E2蛋白反應。E2蛋白N端的6個Cys殘基通過相互形成二硫鍵對維持抗原區(qū)域的構(gòu)象起到關(guān)鍵作用,任何Cys殘基的突變將影響相應抗體對該區(qū)域的識別。我們通過真核細胞表達不同Cys突變的重組E2以鑒定不同單抗的識別區(qū)域,發(fā)現(xiàn)1E7和688識別位于抗原區(qū)域B/C中的構(gòu)象表位,而286能與所有Cys突變的E2蛋白反應,進一步證實該單抗識別的是一線性表位,因此不受E2抗原區(qū)域二級結(jié)構(gòu)的影響。

12、應用上述單抗進行流行毒株E2抗原多樣性分析,結(jié)果表明:單抗286識別的抗原表位只存在于group1毒株中；而單抗1E7和688除了不能與LS-05和QZ2-06毒株E2發(fā)生反應(因為這兩個毒株Cys737突變?yōu)锳rg,破壞了B/C抗原區(qū)的構(gòu)象),與大部分毒株(8/10)均能發(fā)生反應。但是1E7和688與流行毒株的反應性比group1毒株要弱。5、攜帶流行毒株E2基因的重組豬瘟病毒C株構(gòu)建與鑒定
　　 鑒于流行于我省的CSFV毒株

13、的E2蛋白分子進化特征及抗原多樣性,特別是與疫苗毒株C株相比存在較大差異,可能影響疫苗的免疫保護效力。因此,我們建立了CSFV-C株的反向遺傳學操作系統(tǒng),結(jié)合分子流行病學研究結(jié)果,構(gòu)建了基于C株、攜帶流行CSFV毒株E2基因的重組病毒。首先,我們對覆蓋CSFV-C株基因組的6個cDNA片段按一定的策略依次克隆于改造的低拷貝質(zhì)粒,并插入于T7啟動子下游,構(gòu)建了C株的感染性克隆pA-FL22。以線性化的pA-FL22為模板,體外轉(zhuǎn)錄的RNA

14、轉(zhuǎn)染細胞后,熒光定量PCR和IFA檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)錄的RNA在ST細胞中的復制、翻譯水平明顯高于PK-15。獲得的子代病毒FL22注射家兔,產(chǎn)生與親本毒株C株相同的體溫反應,脾臟腫大。作為遺傳標記的Ncol位點在子代病毒體內(nèi)外復制增殖過程中能穩(wěn)定遺傳。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建并拯救了攜帶石門毒株和流行毒株HZ1-08的E2抗原區(qū)域(870bp)的重組病毒FL22-SM-E2和FL22-HZ-E2。兩個重組病毒能夠通過上述建立的MspI酶切方法與

15、C株相區(qū)別,而且重組病毒FL22-HZ-E2還能通過與C株E2單抗反應性的不同與C株相區(qū)別。因此,本試驗建立的CSFV感染性克隆與重組病毒拯救體系是成功的。
　　 總之,本研究深入探索了目前流行于浙江地區(qū)CSFV-E2的分子變異特征,初步探明了它們與疫苗株在抗原結(jié)構(gòu)上的差異,建立了CSFV野毒感染和疫苗毒株的鑒別檢測和分型技術(shù)體系,特別是CSFV感染性克隆的構(gòu)建與重組病毒拯救體系的成功建立為新型標記疫苗的開發(fā),CSFV的復制機制