SLPI啟動子調控靶向EGFR的人工microRNA用于喉癌的基因治療研究.pdf

1、背景:
　　喉癌是上呼吸道最常見的惡性腫瘤，占頭頸部腫瘤的25％左右。傳統(tǒng)的喉癌治療手段為根治性手術或放射治療，輔以或不輔以化學治療，但是傳統(tǒng)治療手段導致的喉功能部分甚至全部喪失或嚴重的副反應極大地影響了患者的生存質量，且仍有部分患者出現治療后復發(fā)。盡管手術術式、放療方法及化療方案在革新中不斷進步，近30年來患者的生存率并無明顯改善。而失去根治性治療機會的晚期患者多行姑息性化療，長期以來該期患者的5年生存率始終停留在30％左右。<

2、br>　　近20年來，分子靶向治療作為一種新型的治療手段在腫瘤的治療中取得了重大突破。對于頭頸部鱗狀細胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC)，最具代表性的分子靶向藥物為特異性抑制表皮生長因子受體(EpidermalGrowth Factor Receptor, EGFR)的單克隆抗體及小分子酪氨酸激酶抑制劑。然而以吉非替尼為代表的小分子抑制劑對HNSCC并無明確療效，而以西妥西單抗

3、為代表的單克隆抗體雖然對傳統(tǒng)的放、化療起到一定的輔助作用，然而由于有限的反應率，較高的耐藥率及頻發(fā)的皮膚毒性、消化道癥狀等副作用使得該類藥物的應用空間仍然不大。
　　隨著分子克隆技術的進步，以病毒為表達載體，通過RNA干擾技術特異性下調EGFR表達的基因治療策略為腫瘤的治療開辟了新的方向。而隨著RNA干擾技術的不斷改進，目前已出現人工microRNA(artificial microRNA，amiR)，即第二代shRNA，與siR

4、NA及第一代shRNA相比，人工microRNA在保留第一代shRNA發(fā)夾結構的基礎上，加入了天然microRNA的框架，除了更高效之外，最大的優(yōu)勢在于可以被哺乳動物體內大多數的啟動子所啟動。而人工microRNA的這一優(yōu)勢使得采用腫瘤組織特異性啟動子來調控靶向EGFR的RNA干擾成為可能。
　　基于以上研究背景，我們擬設計以EGFR為靶點的人工microRNA，并利用重組腺病毒為載體，通過喉癌特異性的SLPI啟動子調控該人工mi

5、croRNA的表達，并以Hep-2為研究對象，探討該基因治療策略抑制腫瘤生長的作用。
　　目的:
　　構建荷載有在SLPI啟動子調控下的靶向EGFR的人工microRNA的重組腺病毒載體，并研究其安全性及對喉癌細胞的體內外抑制作用。
　　方法:
　　1.構建腺病毒穿梭質粒pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA，Ad-SLPI-GFP-pA，分別與骨架質粒pBGHlox(delta) E1，3Cre共轉染H

6、EK293細胞進行腺病毒包裝。以PCR，westem blot等方法鑒定重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR，Ad-SLPI-GFP。擴增病毒，并以CsCl密度梯度離心法純化擴增的腺病毒，TCID50法測定病毒滴度。
　　2.將重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR及對照病毒Ad-SLPI-GFP分別感染人喉鱗狀上皮癌細胞株Hep-2和人正常臍靜脈內皮細胞株HuVEC，通過顯微鏡觀察，MTT，流式細胞儀細胞凋亡分析檢測病

7、毒對喉癌細胞Hep-2及正常細胞HuVEC增殖的影響。
　　3.建立裸鼠喉癌荷瘤模型，予瘤內注射重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR、Ad-SLPI-GFP，或每日口服吉非替尼。比較治療過程中各組瘤體體積變化及觀察期結束后的瘤體重量。觀察治療過程中裸鼠的飲食、活動及精神狀態(tài)，并比較裸鼠體重的變化情況。
　　結果:
　　1.重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR，Ad-SLPI-GFP的包裝，鑒定、擴增、純化及

8、滴度測定腺病毒穿梭質粒pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA、 pDC312-SLPI-GFP-pA分別與骨架質粒pBGHlox(delta) E1，3Cre共轉染HEK293細胞，轉染第13天左右，倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現80％以上的細胞都發(fā)生細胞病變效應，呈葡萄狀，貼壁不牢易脫落。收集感染細胞，反復凍融，病毒上清經蛋白酶K處理后，PCR檢測示Ad-SLPI-EGFRamiR擴增出不同重復序列數的EGFRamiR片段，142bp

9、、284bp、426bp片段，Ad-SLPI-GFP擴增出1482bp片段，示重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR及對照病毒Ad-SLPI-GFP構建成功。予擴增純化后進行滴度測定。Ad-SLPI-EGFRamiR滴度為1×1010pfu/ml，Ad-SLPI-GFP滴度為6.3×109pfu/ml。
　　Western blot結果顯示，Ad-SLPI-EGFRamiR病毒作用72小時的Hep-2細胞，170kdEGFR表

10、達顯著降低。而Ad-SLPI-GFP感染72小時后，熒光顯微鏡下可見大量Hep-2細胞呈現較強的綠色熒光信號，而HuVEC細胞仍無綠色熒光。以上結果表明，SLPI啟動子能夠在喉癌細胞內有效下調EGFR，并特異性調控綠熒光蛋白在人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2細胞中表達，而在正常人臍靜脈內皮細胞HuVEC中無表達，72小時為合適的感染時間。
　　2.重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR對喉癌細胞Hep-2的體外抑制作用
　

11、　2.1 重組腺病毒對細胞增殖抑制作用的試驗MTT結果顯示，感染72小時后重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR對堠癌細胞Hep-2的增殖有較強的抑制作用，在MOI為50pfu/cell時就能有效地抑制喉癌細胞的增殖（抑制率為22.5％），但對正常細胞HuVEC的增殖卻無明顯抑制作用(抑制率為-4.2％)。
　　2.2 重組腺病毒作用72小時后細胞形態(tài)學變化重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR(MOI=50)作用72小時

12、后的喉癌細胞Hep-2在形態(tài)學上發(fā)生了顯著的變化:細胞變圓，皺縮，部分呈串珠狀、浮起。而正常細胞HuVEC在病毒作用前后細胞形態(tài)差異不明顯。而對照病毒Ad-SLPI-GFP(MOI=50)作用前后，Hep-2及HuVEC細胞形態(tài)均無明顯差異。
　　2.3 流式細胞儀定量分析細胞凋亡流式細胞儀檢測顯示重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR在MOI=35及MOI=50下作用72小時后，Hep-2細胞的凋亡率（即Annexin V-

13、R-PE和7-AAD均染色的細胞）分別為32.8％和31.8％，而Ad-SLI-GFP作用72小時后相應的凋亡率分別為9.2％和10.0％，兩種病毒差異顯著，從定量角度說明重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR能通過有效誘導凋亡而對喉癌細胞的生長增殖起抑制作用。而對于正常臍靜脈內皮細胞HuVEC，在MOI=35的Ad-SLPI-EGFRamiR，Ad-SLPI-GFP作用72小時后的凋亡率分別為11.1％，8.2％，在MOI=50的

14、相應病毒作用下凋亡率分別為15.5％，4.8％，差異均不顯著。
　　3.重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR對喉癌荷瘤模型腫瘤組織生長的抑制作用
　　3.1 重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR的體內抑制腫瘤生長作用在首次治療后第13天，Ad-SLPI-EGFRamiR治療組的瘤體體積小于Ad-SLPI-GFP組及吉非替尼組，但是這一差別無統(tǒng)計學上的顯著意義(P＞0.05)。與首次治療日的瘤體體積相比，Ad-SL

15、PI-EGFRamiR組的瘤體體積增長速度小于Ad-SLPI-GFP組及吉非替尼組，但是仍無統(tǒng)計學上的顯著意義(P＞0.05)。在觀察結束時（首次給藥后第20天）Ad-SLPI-EGFRamiR組瘤重小于Ad-SLPI-GFP組及吉非替尼組，但這一差別無統(tǒng)計學上的顯著意義(P＞0.05)。
　　3.2 重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR的體內不良反應觀察在治療過程中，Ad-SLPI-EGFRamiR組及Ad-SLPI-GF

16、P組裸鼠的身體狀況良好，精神狀態(tài)、活動及飲食情況均無明顯異常。但是吉非替尼組的部分小鼠出現精神萎靡、腹瀉、食欲不振情況。Ad-SLPI-EGFRamiR組裸鼠的體重增長率與Ad-SLPI-GFP組裸鼠相比無明顯差異(P＞0.05)，但是卻明顯高于吉非替尼組(P＜0.05)。
　　研究結論:
　　1.重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR和Ad-SLPI-GFP均能有效感染Hep-2細胞，并表達相應的基因，具有良好的喉癌組