利用PCNA啟動子構建一個可用于惡性膠質瘤基因治療的增殖特異性啟動子.pdf

1、目的:
　　通過對PCNA啟動子不同區(qū)段在惡性膠質瘤細胞系及永生化非腫瘤細胞系中轉錄效率的定性定量檢測，篩選出攜帶增殖特異性的區(qū)段，并通過對該區(qū)段的改造進一步提高轉錄效率及轉錄起始位點穩(wěn)定性，以構建一個可用于惡性膠質瘤基因治療的增殖特異性啟動子，使其適用于啟動外源性抑癌基因、反義RNA等表達和介導內源性致癌基因RNA沉默的shRNA表達。
　　方法:
　　1.以人基因組DNA為模板，應用PCR方法擴增出PCNA啟動子-

2、778bp～+122bp、-538～+62、-256～+62多個區(qū)段。2.將其克隆入綠色熒光蛋白報告基因載體pEGFP-1中，分別轉染膠質瘤細胞系TJ905和永生化非腫瘤細胞系293，定性觀察綠色熒光蛋白的表達。3.將其克隆入熒光素酶報告載體pGL3—Basic、pGL3—Ehance中，利用熒光素酶檢測試劑盒定量觀察上述片段在TJ905和293中的轉錄活性。4.改造900bp區(qū)段，構建啟動子PTAI，測序正確后轉染TJ905和293細

3、胞系，定性定量觀察并與上述PCNA不同區(qū)段進行對比，以確定該載體的轉錄效率和增殖特異性。
　　結果:
　　1.瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR克隆的PCNA啟動子片段大小正確，測序完整無突變。2.對綠色熒光蛋白和熒光素酶的定性定量觀察顯示，上述啟動子均能介導報告基因的表達，但各區(qū)段的轉錄活性各不相同。900bp在TJ905和293中的轉錄效率明顯高于600bp和300bp。在TJ905中900bp的轉錄效率明顯高于293中的轉錄活性

4、。3.限制性酶切分析和DNA測序證實PTAI改造成功。4.通過對綠色熒光蛋白和熒光素酶的定性定量檢測，PTAI在TJ905中轉錄活性明顯高于900bp，特別是加入增強子后活性更強，但其在293中的轉錄活性兩者無統(tǒng)計學差異。
　　結論:
　　克隆及改造的人PCNA啟動子的不同區(qū)段在膠質瘤細胞中有高效啟動活性。特別是加入SV40增強子后其轉錄活性增加5～8倍，同時不影響其增殖特異性，有可能成為潛在的活性更高的腫瘤特異性啟動子系統(tǒng)