脂肪酸合成酶啟動子靶向乳腺癌基因治療的實驗研究.pdf

1、乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，占女性所有癌癥相關(guān)死亡率的第二位。繼手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療外，分子靶向藥物的應(yīng)用成為攻克腫瘤治療的又一手段?？笻er-2單克隆抗體Herceptin是最常用的乳腺癌分子靶向藥物，但僅對Her-2過表達(dá)者發(fā)揮作用，而Her-2過表達(dá)者僅占乳腺癌患者的30％，且大部分患者在用藥一年內(nèi)發(fā)生耐藥。因此臨床上急需找到乳腺癌治療新的靶點。近年來發(fā)現(xiàn)，脂肪酸代謝和機(jī)體的能量平衡與各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，能

2、量鏈中的核心分子脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）作為一種新的代謝性癌基因成為研究的熱點。FAS在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，但在絕大部分人類惡性腫瘤及癌前病變組織中過表達(dá)并具有高活性，是腫瘤細(xì)胞最普遍的分子變化之一。FAS在侵襲型乳腺癌組織中高表達(dá)，并與其惡性表型和較差的臨床預(yù)后密切相關(guān)，是獨立的影響臨床預(yù)后因素。因此，F(xiàn)AS成為腫瘤治療的一個新的靶點。本研究將FAS啟動子、單純皰疹病毒胸苷激酶（herpes

3、 simplex virus thymidine kinase，HSV-TK）基因和腺病毒結(jié)合到一起，設(shè)計了一種新型靶向乳腺癌基因治療方法。該方法克服了傳統(tǒng)基因治療轉(zhuǎn)染效率低、靶向性差以及靶向抗原表達(dá)差異大的缺點，有望在臨床腫瘤治療中得以廣泛應(yīng)用。 目的：建立一種新型安全有效的乳腺癌基因治療體系，并對其靶向乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用進(jìn)行評估，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 方法 ①利用western blot 和間接免疫熒光

4、法檢測FAS 在包括乳腺癌細(xì)胞系在內(nèi)的7種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。 ②兩步法PCR 克隆具有關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的FAS 啟動子、粘蛋白4（mucin4，MUC4）啟動子片段。從pGEM-Teasy-cerbB2 和pGL2-basic-MK 載體中獲得cerbB2 啟動子以及中期因子（midkine，MK）啟動子片段。 ③利用基因重組的方法構(gòu)建含腫瘤特異性啟動子FAS、MUC4、cerbB2 以及MK 的重組熒光素酶表達(dá)載體，并

5、檢測它們在腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性。 ④PCR 法克隆含polyA 尾的HSV-TK 全長cDNA，構(gòu)建FAS 啟動子驅(qū)動的HSV-TK 重組腺病毒穿梭載體pshuttle-FAS-TK，并與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1 以電穿孔法在BJ5183 菌中同源重組，獲得重組腺病毒載體rAdeno-FAS-TK。 ⑤將線性化的rAdeno-FAS-TK 以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染QBI-293A 細(xì)胞，制備和純化復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-

6、FAS-TK。 ⑥免疫熒光法和MTT 法檢測不同MOI 的Ad-GFP 對乳腺癌細(xì)胞SK-Br3 的感染能力和存活影響。MTT 法和平板克隆形成實驗檢測Ad-FAS-TK 聯(lián)合前體藥物GCV 對三種乳腺癌細(xì)胞的靶向細(xì)胞毒作用。 ⑦流式細(xì)胞法和TUNEL 法評估Ad-FAS-TK/GCV 對SK-Br3 乳腺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。 結(jié)果 ①Western blot 和間接免疫熒光結(jié)果表明，F(xiàn)AS 在SK-B

7、r3 和SGC-7901 細(xì)胞系中表達(dá)最高，在MCF-7、A549 以及HepG2 細(xì)胞系中中等表達(dá)，在Hela和MDA-MB-231 細(xì)胞系中表達(dá)較低，而在正常成纖維細(xì)胞NIH3T3 細(xì)胞中不表達(dá)。FAS 蛋白主要定位于胞質(zhì)中。 ②以人基因組DNA 為模板，經(jīng)兩步法PCR 擴(kuò)增出約680bp 的FAS 啟動子片段和約625bp 的MUC4 啟動子片段?；蛑亟M法獲得約258bp 的cerbB2 啟動子片段和約600bp 的MK

8、 啟動子片段。 ③構(gòu)建pGL3-FAS、pGL3-MUC4、pGL3-cerbB2 和pGL3-MK 熒光素酶表達(dá)載體。熒光素酶檢測結(jié)果顯示，pGL3-FAS 在受檢測的各腫瘤細(xì)胞系中均具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，而在正常成纖維細(xì)胞NIH3T3 中，幾乎無轉(zhuǎn)錄活性。MUC4啟動子與FAS 啟動子相比，在各腫瘤細(xì)胞間的轉(zhuǎn)錄活性差異較大。FAS 啟動子較MUC4 啟動子更適合作為廣譜腫瘤特異性啟動子。FAS 啟動子在人乳腺癌細(xì)胞系SK-Br

9、3、MCF-7 以及MDA-MB-231 中具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，對于Her-2表達(dá)陽性或陰性的細(xì)胞均具有高轉(zhuǎn)錄活性，較cerbB2 啟動子作用范圍更為廣泛，較MK 啟動子轉(zhuǎn)錄活性更高。 ④構(gòu)建含完整表達(dá)框的重組腺病毒穿梭載體pshuttle-FAS-TK。Pshuttle-FAS-TK與pAdeasy-1 同源重組，獲得重組腺病毒載體rAdeno-FAS-TK。線性化的rAdeno-FAS-TK在QBI-293A細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增、純

10、化、濃縮，經(jīng)TCID50 法測定，獲得滴度約為1×1010pfu/mL的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-FAS-TK。 ⑤ Ad-GFP 在MOI 在50-100 時，感染乳腺癌細(xì)胞SK-Br3 細(xì)胞的能力最強(qiáng)，且對細(xì)胞活性沒有太大影響。Ad-FAS-TK/GCV 可誘導(dǎo)三種乳腺癌細(xì)胞明顯的細(xì)胞毒作用，而正常成纖維細(xì)胞NIH3T3 則不敏感。在較高的病毒MOI 條件下，三種乳腺癌細(xì)胞對GCV 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用呈劑量依賴型增加。但是在較

11、低的病毒MOI 條件下，隨著GCV 濃度的增加，三種乳腺癌細(xì)胞對GCV誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用逐漸達(dá)到一個平臺。在相同GCV 條件下，隨著MOI 的增加，三種乳腺癌細(xì)胞的存活率呈劑量依賴型降低。在三種乳腺癌細(xì)胞中，SK-Br3 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用最明顯。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，Ad-FAS-TK/GCV 處理后的三種乳腺癌細(xì)胞的克隆形成能力幾乎被完全阻斷，而對正常成纖維細(xì)胞NIH3T3 的克隆形成能力幾乎沒有影響。 ⑥D(zhuǎn)eadEnd 熒

12、光法TUNEL檢測顯示， TM 在Ad-FAS-TK（MOI 10）/GCV（1μg/mL）作用48hr時即可觀察到SK-Br3 細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞法檢測出明顯的凋亡峰，細(xì)胞周期也有所改變，與無任何處理的對照相比，G2-M期亞群減少，S期亞群增加。 結(jié)論 ①FAS 蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與Her-2/neu 的表達(dá)水平密切相關(guān)。 ②FAS 啟動子具有高效特異性靶向多種腫瘤細(xì)胞的特點，可以作為腫瘤靶向的調(diào)控元素用于

13、惡性腫瘤的靶向基因治療。 ③成功構(gòu)建FAS 啟動子驅(qū)動的HSV-TK 重組復(fù)制缺陷型腺病毒。 ④重組腺病毒Ad-FAS-TK 聯(lián)合GCV 對乳腺癌細(xì)胞具有靶向細(xì)胞毒作用，且這種細(xì)胞毒作用至少部分通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑而實現(xiàn)。 綜上所述，成功建立FAS 啟動子驅(qū)動的HSV-TK 腺病毒靶向基因治療方法，并在體外試驗中證實該方法可高效、安全的靶向乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用，為乳腺癌以及其它腫瘤的基因治療提供新的途徑，具