不同干預(yù)條件對(duì)大鼠胚胎肝干細(xì)胞體外培養(yǎng)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、干細(xì)胞治療已成為目前國(guó)內(nèi)外生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。能夠應(yīng)用于治療的干細(xì)胞來(lái)源很多，其中胎肝中富含具有雙向分化潛能的干細(xì)胞，被認(rèn)為是一個(gè)重要細(xì)胞來(lái)源。但由于某些原因如體外分離純化困難、增殖及分化機(jī)制不明等，限制了胎肝干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。建立快捷、有效的提取方法，以及在培養(yǎng)中調(diào)控細(xì)胞高效增殖及誘導(dǎo)其定向分化一直是學(xué)者們努力的方向。優(yōu)化胎肝干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，能夠?yàn)樘ジ胃杉?xì)胞的臨床應(yīng)用研究奠定重要的基礎(chǔ)。
　　目的：
　　本研究擬探討

2、體外高效擴(kuò)增大鼠胚胎肝干細(xì)胞的方法。根據(jù)細(xì)胞外誘導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)可分為兩個(gè)部分：1、檢測(cè)可否通過(guò)沉默RhoA基因的方法優(yōu)化胎肝干細(xì)胞培養(yǎng)；2、研究不同濃度肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）和表皮生長(zhǎng)因子（epidermalgrowthfactor，EGF）對(duì)大鼠胎肝干細(xì)胞體外增殖的影響，探索二者間有無(wú)協(xié)同作用。
　　方法：
　　1.將取自孕14天胎齡的F344大鼠胚胎肝組織的肝干細(xì)胞體外培養(yǎng)

3、，經(jīng)小分子干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）轉(zhuǎn)染以沉默RhoA基因表達(dá)，分為3組：A：胎肝干細(xì)胞組；B：經(jīng)隨機(jī)打亂順序的siRNA轉(zhuǎn)染的胎肝干細(xì)胞組；C：經(jīng)特異siRNA轉(zhuǎn)染的胎肝干細(xì)胞組。用Westernblot及RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后胎肝干細(xì)胞RhoA的蛋白和基因表達(dá)。應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT）觀(guān)察各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞周期分布變化。
　　2.取孕14天胎齡F3

4、44大鼠胚胎的胎肝，經(jīng)三步分離法分離純化后，配置不同濃度HGF、EGF及HGF和EGF聯(lián)合組培養(yǎng)基，將胎肝干細(xì)胞分組培養(yǎng)。光鏡下觀(guān)察細(xì)胞增殖狀況，MTT法觀(guān)察不同濃度和不同時(shí)間HGF、EGF及HGF和EGF聯(lián)合對(duì)大鼠胎肝干細(xì)胞增殖的影響，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染特異siRNA組的胎肝干細(xì)胞RhoA基因表達(dá)量明顯降低（p<0.05），Westernblot顯示轉(zhuǎn)染特異siRNA組胎肝干細(xì)胞R

5、hoA蛋白表達(dá)量明顯降低（p<0.05），MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染特異siRNA組的胎肝干細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯增快，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染特異siRNA組細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞減少，S期細(xì)胞數(shù)增多，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。
　　2.HGF10～80ng/ml各濃度組，EGF10～80ng/ml各濃度組增殖效應(yīng)均大于對(duì)照組。當(dāng)HGF為20ng/ml，增殖效應(yīng)明顯大于對(duì)照組（p<0.01），當(dāng)HGF濃度繼續(xù)增高時(shí)，增殖效應(yīng)無(wú)明顯

6、增高。將20ng/mlHGF組與不同濃度EGF組合后分組培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)20ng/mlHGF和10ng/mlEGF聯(lián)合組增殖效應(yīng)明顯升高，繼續(xù)升高聯(lián)合組中EGF濃度，增殖效應(yīng)無(wú)明顯提高。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)siRNA干擾的方法可以有效的沉默RhoA基因并促進(jìn)大鼠胎肝干細(xì)胞增殖，對(duì)其培養(yǎng)有優(yōu)化作用。
　　2.HGF和EGF具有明顯改善大鼠胎肝干細(xì)胞體外無(wú)血清培養(yǎng)條件的作用，二者對(duì)大鼠胎肝干細(xì)胞體外培養(yǎng)具有協(xié)同促進(jìn)作用