異硫氰酸苯乙酯與紫杉醇協(xié)同抗乳腺癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、乳腺癌是目前世界上第二最常見的癌癥并且在癌癥致死因為中居第五位。紫杉醇(paclitaxel,taxol PTX)通過與微管蛋白結(jié)合促其形成微管并抑制其解聚而起到抗腫瘤作用。目前,廣泛的應(yīng)用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等實體瘤的治療,但是其毒副作用在一定程度上限制了他的應(yīng)用。異硫氰酸苯乙酯(phenethylisothiocyanate PEITC)是新發(fā)現(xiàn)的去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitorHDAC

2、i),能與微管蛋白結(jié)合,在體內(nèi)和體外抑制腫瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)其凋亡。最主要的是在實驗室研究和健康志愿者中進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗,均未發(fā)現(xiàn)毒副反應(yīng)。由于這兩種藥的不同的抗腫瘤作用,我們期望他們聯(lián)合應(yīng)用能夠增強抗腫瘤作用而減少毒副作用。
　　 目的
　　 研究PEITC和PTX兩藥聯(lián)合作用是否具有協(xié)同的抗腫瘤的效應(yīng)；分析并試圖探明兩藥聯(lián)合作用的相互關(guān)系；進(jìn)一步探索兩藥聯(lián)合作用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制；為臨床聯(lián)合化療的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。<

3、br>　　 方法：
　　 根據(jù)細(xì)胞的生長特性將處于指數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞系MCF7、MDA-MB-231分別分為7組(接受不同濃度的單藥PEITC處理)和7組(接受不同濃度的單藥PTX處理),分析各組細(xì)胞的抑制率,為進(jìn)一步的聯(lián)合給藥選取最適藥物濃度；將處于指數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞系MCF7、MDA-MB-231分別以PTX為固定最適濃度,選取一定的范圍的PEITC的濃度處理兩系細(xì)胞48小時,或者以PEITC為固定最適濃度,選取一

4、定的范圍的PTX的濃度處理兩系細(xì)胞48小時,然后應(yīng)用MTT法檢測各組細(xì)胞的抑制率；通過分析獲得的各處理組的實驗數(shù)據(jù),明確PTX與PEITC之間是否具有協(xié)同抗腫瘤的作用。若存在協(xié)同抗腫瘤的作用,依據(jù)前面所得的實驗條件,應(yīng)用一般傳代方法收集的處于指數(shù)生長期的MCE7和MDA-MB-231兩系細(xì)胞,在25ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)兩系細(xì)胞(藥物處理組為PEITC+PTX組,單藥PEITC組,單藥PTX組),收集對照組及經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞,按照流式細(xì)胞儀

5、檢測的流程,制成標(biāo)本,用PI染色后上流式細(xì)胞儀機(jī)器分析,取得細(xì)胞周期的表達(dá)情況；按照原位細(xì)胞凋亡(TIJNNEL)法檢測細(xì)胞凋亡的流程和要求,制取TIJNNEL法分析細(xì)胞凋亡分析的標(biāo)本,分析細(xì)胞凋亡的情況。按照Western-Blot的流程制取標(biāo)本,用其分析各蛋白的表達(dá)情況。按照HDAC6活性檢測試劑盒的說明,制取標(biāo)本,分析不同的藥物使用方案對HDAC6活性的影響。按照激光共聚焦顯微鏡操作的要求,獲取標(biāo)本,對不同的組進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡

6、。統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS10.0版統(tǒng)計軟件的進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,統(tǒng)計學(xué)處理采用t檢驗、單因素方差分析,多重比較采用LSO法,構(gòu)成比的比較采用卡方檢驗,以p<0.05為差異有顯著性意義,以p<0.01為差異極有顯著性意義。IC50,半數(shù)抑制濃度和協(xié)同效應(yīng)使用Calcusyn計算軟件(Biosoft,Inc)求得。
　　 結(jié)果：
　　 1.PEITC和PTX對乳腺癌細(xì)胞的影響PEITC對MCF7作用24小時和48小時后的IC5

7、0分別為9.23μM和5.61μM；PEITC對MDA-MB-231作用24小時和48小時后的IC50分別為22.461μM和15.691μM；結(jié)合曲線的走勢,我們可知,PEITC對MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用具有濃度和時間依賴性。結(jié)合該曲線和國內(nèi)外實驗用藥濃度及臨床血藥濃度分布特點,我們選定PEITC5μM和10μM作用48小時分別為MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞的在該實驗的實驗終濃度。PTX對MCF7作用24小時

8、和48小時后的IC50分別為1870.11nM和111.26nM；PEITC對MDA-MB-231作用24小時和48小時后的IC50分別為2214.32nM和409.58nM；結(jié)合曲線的走勢,我們可知,PTX對MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷作用具有濃度和時間依賴性。結(jié)合該曲線和國內(nèi)外實驗用藥濃度及臨床血藥濃度分布特點,我們選定PTX10nM和100nM作用48小時分別為MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞的在該實驗的實驗終濃度。

9、2.PTX與PEITC同時聯(lián)合用藥的抗腫瘤作用情況以固定的PTX濃度分別與PEITC各種濃度作用,在MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞中PEITC的IC50分別降低了2.6倍和7.3倍。以固定的PEITC濃度分別與PTX各種濃度作用,在MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞中PTX的IC50分別降低了37倍和50倍。應(yīng)用CalcuSyn2.0軟件分析PEITC與PTX在MCF7細(xì)胞中的聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn):在MCF7細(xì)胞中,兩藥聯(lián)合在很多點均有協(xié)同

10、的抗腫瘤作用,其中PEITC5μM作用效果最好,PTX10nM作為聯(lián)合作用效果最好。在MDA-MB-231細(xì)胞中,兩藥聯(lián)合在很多點均有協(xié)同的抗腫瘤作用,其中PEITC10μM作用效果最好,PTX100nM作為聯(lián)合作用效果最好。3.PEITC與PTX聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞周期的影響我們發(fā)現(xiàn)在MCF7細(xì)胞系PTX10nM能使6.34％的MCF7細(xì)胞停滯在G2/M期,PEITC5μM能使8.94％的的MCF7細(xì)胞停滯在G2/M期,聯(lián)合起來

11、共同作用于MCF7細(xì)胞系時會有43.2％的細(xì)胞停滯于G2/M期(統(tǒng)計分析結(jié)果:PEITC組與PEITC+PTX組相比P=0.0012<0.01,PTX組與PEITC+PTX組相比P=0.002<0.01),在MDA-MB-231細(xì)胞系PEITC10μM和PTX100nM單藥分別能產(chǎn)生17.08％和14.35％的G2/M細(xì)胞停滯,而聯(lián)合應(yīng)用則會達(dá)到57.1％的G2/M細(xì)胞停滯(統(tǒng)計分析結(jié)果:PEITC組與PEITC+PTX組相比P=0.0

12、03<0.01,PTX組與PEITC+PTX組相比P=0.006<0.01)4.PEITC與PTX聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響我們發(fā)現(xiàn)在MCF7細(xì)胞PTX10nM單藥作用的凋亡率為9.7％±2.8,PEITC51XM單藥作用的凋亡率為8.1％±3.9,而當(dāng)我們將其聯(lián)合起來共同作用于MCF7細(xì)胞系時會有28.1％±3.9凋亡率出現(xiàn)(統(tǒng)計分析結(jié)果:PEITC組與PEITC+PTX組相比P=0.003<0.01,PTX組與PEITC+PTX

13、組相比P=0.002<0.01)。在MCF7細(xì)胞系中聯(lián)合用藥分別比PEITC和PTX單藥誘導(dǎo)的凋亡率高出3.4倍和2.8倍。同樣的,在MDA-MB-231細(xì)胞系PEITC10μM和PTX100nM單藥分別能產(chǎn)生12.8％±2.9和14.5％±3.7的凋亡率,而聯(lián)合應(yīng)用則會達(dá)到32.7％±4.8的凋亡率(統(tǒng)計分析結(jié)果:PEITC組與PEITC+PTX組相比P=0.004<0.01,PTX組與PEITC+PTX組P=0.001<0.01)。

14、在MDA-MB-231細(xì)胞系中聯(lián)合用藥比PEITC和PTX單藥誘導(dǎo)凋亡率高出2倍。5.PEITC與PTX聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌細(xì)胞CyclinB1和cdk1表達(dá)的影響PEITC和PTX聯(lián)合作用與分別單藥作用能夠更顯著的cdk1的表達(dá),與此同時,cyclinB1的表達(dá)保持相對的穩(wěn)定,顯示在兩藥同時作用是主要是抑制CDK1而較少的抑制CyclinB1。6.PEITC與PTX聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的影響通過研究發(fā)現(xiàn)在兩系乳腺癌細(xì)

15、胞系中兩藥聯(lián)合組其Bcl-2的表達(dá)較PEITC和PTX單藥均明顯降低,而Bax在兩藥聯(lián)合用的標(biāo)本中的表達(dá)較PEITC和PTX單藥均明顯增高。7.在兩藥聯(lián)合對乳腺癌細(xì)胞PARP和Caspase的表達(dá)的影響我們發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合作用組的PARP-1裂解片段較PEITC和PTX單藥作用組的PARP-1和Caspase9的裂解片段明顯增加。而采用WestermBlot方法從蛋白水平觀察Caspase9和Caspase3在單藥或聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞

16、凋亡前后的活化情況發(fā)現(xiàn),在聯(lián)合用藥組總的Caspase9和Caspase3較單藥作用時均明顯降低。8.PEITC對乳腺癌細(xì)胞漿中HDAC6活性、微管蛋白和乙?；?微管蛋白的影響PEITC不同的濃度作用下,乳腺癌細(xì)胞中乙酰化的α-微管蛋白會逐漸增加,而與之相對的表現(xiàn)出HDAC6活性的逐漸減低。相同的作用時間內(nèi)隨著PEITC的作用濃度逐漸增高,HDAC6的活性測逐漸減少,從PEITC2.5μM開始,在乳腺癌細(xì)胞就產(chǎn)生抑制,PEITC2.5

17、μM對MCF7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞分別能夠?qū)DAC6的活性產(chǎn)生約20％和10％的抑制；當(dāng)我們給予20μM的PEITC濃度時,能夠?qū)CF7和MDA-MB-231分別產(chǎn)生約70％和60％的抑制。用激光掃描共聚焦顯微鏡和WestcrnBlot進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)PEITC作用后,乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的乙?；摩?微管蛋白增加。隨著PEITC濃度的增加,乳腺癌細(xì)胞的微管蛋白的表達(dá)逐漸減少,到20μM時,乳腺癌細(xì)胞的微觀蛋白表達(dá)幾乎就沒有了。兩藥

18、聯(lián)合應(yīng)用48小時后α-微管蛋白(α-mbulin),β-微管蛋白(β-tubulin)較任何單藥降低的更明顯,與此相對應(yīng)的是乙?；摩?微管蛋白(acetyl-α-tubulin)聯(lián)合用組較任何單藥組明顯升高。
　　 結(jié)論：與創(chuàng)新點
　　 1.PEITC和PTX聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌細(xì)胞能夠產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤效應(yīng)；
　　 2.PEITC和PTX聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌細(xì)胞能夠協(xié)同的誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡效應(yīng)；

19、　　 3.PEITC作為去乙酰基酶抑制劑(HDACi)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞漿中HDAC6的活性；
　　 4.PEITC作為去乙?；敢种苿?HDACi)能夠增加乳腺癌細(xì)胞漿中乙酰化的微管蛋白的表達(dá)；
　　 5.PEITC作為去乙?；敢种苿?HDACi)能夠通過抑制HDAC6的活性而增強α-微管蛋白乙酰化使微管穩(wěn)定,有利于紫杉醇的優(yōu)先結(jié)合,進(jìn)而增強紫杉醇的抗腫瘤性；
　　 6.我們的實驗研究為乳腺癌的臨床化療方案