微小RNA-34a在乳腺癌細胞紫杉醇化療耐藥中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 乳腺癌作為女性中發(fā)病排名第一的惡性腫瘤已經嚴重影響到婦女的健康。雖然中國乳腺癌發(fā)病率低于歐美國家，但是隨著近年國內經濟發(fā)展加速，生活水平提高，飲食結構及生活方式的改變，其發(fā)病率逐年遞增，特別是國內經濟較發(fā)達的地區(qū)，乳腺癌發(fā)病率的上升速度驚人。近年來，隨著疾病診療技術的提升，公眾對健康的愈發(fā)重視，乳腺癌死亡率較前有所下降，但是，由于目前對乳腺癌發(fā)病機制仍然未知，選擇何種治療手段及如何具體操作等問題仍然存在困惑。手

2、術一直以來都是乳腺癌的主要治療方案，但是作為一種全身性疾病，其綜合治療顯得更為關鍵。而其中化學治療有著特別重要的地位，不僅可以為早期乳腺癌患者在術后行輔助治療，進一步防止腫瘤的復發(fā)和轉移，還可以為失去手術機會的晚期患者降低腫瘤分期，從而重新獲得手術機會，延長生存期。而紫杉醇作為治療乳腺癌的化療一線藥物，在治療中已取得了比較理想的效果，被廣泛運用于臨床，許多患者也因此受益。然而，腫瘤細胞對該藥產生耐藥性是乳腺癌化療失敗的主要原因之一。故探

3、討乳腺癌化療耐藥的發(fā)生機制對臨床指導乳腺癌治療方案具有重要的價值。microRNAs(miRNAs)是近年發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于真核生物中，一類長度約21-23個核苷酸不等的不參與編碼的短鏈小分子RNA。它可以通過與下游靶基因的編碼區(qū)或者非編碼區(qū)結合，改變其表達量，從而內源性調節(jié)細胞的分化、增殖、凋亡過程。而新近各項研究結果表明miRNAs的表達改變與多種腫瘤及多種化療藥物敏感性有著緊密關系。本研究通過采用基因轉染技術改變miR34a在乳腺癌

4、細胞株中的表達水平，從而檢測其表達量的改變對乳腺癌紫杉醇化療耐藥的影響及其可能作用機制。
　　 目的：
　　 探討微小RNA-34a(microRNA-34a，miR-34a)表達水平改變對乳腺癌細胞紫杉醇化療耐藥的影響及作用機制。
　　 方法：
　　 設計人工合成的miR-34a模擬序列及干擾序列(miR-34a mimics，miR-34ainhibitor)，通過LipofectamineTM200

5、0轉染MCF-7及MCF-7/紫杉醇耐藥細胞株(MCF-7/TAXOL)，采用實時熒光定量PCR技術(Real-time PCR)檢測轉染前后細胞中miR-34a表達水平，CCK8檢測轉染前后腫瘤細胞經紫杉醇干預后的細胞存活情況并檢測各自半數(shù)抑制濃度(IC50)，Western blot法檢測細胞轉染前后Bcl-2蛋白表達情況。
　　 結果：
　　 1、應用Real-time PCR法檢測乳腺癌細胞株MCF-7、MCF-

6、7/TAXOL中miR-34a的表達，結果顯示，常規(guī)培養(yǎng)的MCF-7/TAXOL細胞株中miR-34a的表達量相對MCF-7明顯增高（6.91±2.04，P＜0.05）。
　　 2、經miR-34a mimics轉染后的MCF-7中miR-34a表達較轉染相應陰性序列的對照組表達明顯增高:(168.98±18.943) vs(0.99±0.12)，P＜0.001;相反，經miR-34a inhibitor轉染后的MCF-7/TA

7、XOL中miR-34a表達較轉染相應陰性序列的對照組明顯減少:(0.007±0.001) vs(0.97±0.02)，P＜0.001。
　　 3、將轉染miR-34a mimics和inhibitor及轉染相應陰性對照序列(negativecontrol，NC)的兩株細胞分成兩組:經miR-34a mimics轉染的MCF-7和轉染相應NC的對照組MCF-7、經miR-34a inhibitor轉染的MCF-7/TAXOL和轉染

8、相應NC的對照組MCF-7/TAXOL。應用CCK-8法檢分組測轉染后細胞在紫杉醇不同濃度下的存活情況，當MCF-7細胞中miR-34a表達上調時，MCF-7對紫杉醇的敏感性明顯降低，轉染組與對照組的IC50分別為(9.91±0.58) vs(2.81±0.41)mg/L，P＜0.05;當miR-34a表達下調時，MCF-7/TAXOL對紫杉醇的敏感性明顯增高，轉染組與對照組的IC50分別為(2.67±0.48) vs(7.36±0.6

9、0) mg/L，P＜0.05。
　　 4、應用Western blot方法分析miR-34a表達改變后，MCF-7和MCF-7/TAXOL中Bcl-2的表達情況，當miR-34a表達上調時，MCF-7細胞中Bcl-2表達量明顯降低，轉染組與對照組蛋白表達量分別為(0.11±0.01) vs(0.91±0.03)，P＜0.05;當miR-34a表達下調時，MCF-7/TAXOL細胞中Bcl-2表達量明顯增加，轉染組與對照組蛋白表達