西達本胺對乳腺癌細胞的作用及其機制研究.pdf

1、背景：
　　乳腺癌影響婦女身心健康，嚴(yán)重時危及生命，在我國女性惡性腫瘤中排在首位。在全球范圍內(nèi)，我國占據(jù)每年新診斷乳腺癌病例約12.2％，死亡病例約9.6%?；蛲蛔兒透邼舛燃に氐鹊拈L期作用是乳腺癌產(chǎn)生的高危因素，對于有著高危因素的患者可以給予預(yù)防性的雙側(cè)“乳腺切除術(shù)”或“卵巢切除”，因手術(shù)存在很多的副作用，實行手術(shù)前應(yīng)考慮全面，權(quán)衡利弊。乳腺癌除了手術(shù)治療外，還有新輔助治療和輔助治療。各種治療的綜合運用，使乳腺癌的臨床療效有了明

2、顯的提高。乳腺癌的分子分型及其指導(dǎo)下的分類治療，以及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是當(dāng)今研究熱點。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展除了基因突變這個因素外，表觀修飾也日益受到關(guān)注。乙酰化和去乙?；潜碛^修飾里非常重要的修飾方式。組蛋白乙?；腿ヒ阴；綄τ谡婧思毎娜旧|(zhì)的重組和基因的表達有著重要的影響，組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙?；?HDAC)相互制約，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)核心組蛋白乙?；腿ヒ阴；膭討B(tài)平衡組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；傅恼{(diào)節(jié)失去平衡時，會導(dǎo)致基

3、因轉(zhuǎn)錄改變，促進腫瘤的發(fā)生。組蛋白去乙?；竿ㄟ^使組蛋白去乙?；?，讓 DNA更緊地纏繞在組蛋白上，從而導(dǎo)致這些DNA不易被基因轉(zhuǎn)錄因子接觸，影響與細胞增值、周期、凋亡等有關(guān)的蛋白的表達，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，所以近年來組蛋白去乙?；钢饾u成為抗腫瘤藥研究的新靶點各種組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi）在癌癥的表觀修飾方面的作用已逐漸被發(fā)現(xiàn)，但具體機制有待進一步研究，中國自主研發(fā)的HDACi類藥物西達本胺在機制研究方面還相對偏少，尤其在乳

4、腺癌上的作用機制還尚不清楚。
　　目的:
　　組蛋白去乙?；敢种苿┦且环N新型的抗癌藥物，能夠抑制腫瘤的生長，阻滯細胞周期和促進細胞凋亡。一個非常重要的口服HDACi類藥物西達本胺（Chidamide），單藥或聯(lián)合在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤或固體瘤中使用，都表現(xiàn)出了很好的抗腫瘤作用，在較多的腫瘤中都具有明顯的周期阻滯和促進凋亡的作用，但詳細的分子機制還不是特別清楚。本實驗觀察西達本胺體外對乳腺癌MCF7和MDA-MB453細胞增殖、

5、形態(tài)、凋亡和周期的影響，并研究其可能的抗腫瘤作用機制。
　　方法:
　　在96孔板上按照5X103個/孔種板，待細胞貼壁后用西達本胺（0、20、40、60、80、100μmol/L）對MCF7和MDA-MB453細胞分別處理24、48、72小時，用7Sea-CCK對細胞的增殖情況進行評估，計算細胞被抑制的情況。
　　在6孔板上按照3X105個/孔種板，待細胞貼壁后用西達本胺（0、20、40、80μmol/L）對MCF7

6、和MDA-MB453細胞分別處理48小時，收集處理后的細胞至流式管，并加入DNA染色液（Staining solution）和滲透液（Permeabilization solution），混勻后避光孵育30分鐘，上流式細胞儀檢測細胞周期分布；用相同的方法收集細胞至流式管后，加入Binding buffer、FITC Annexin和PI，混勻后避光孵育15分鐘，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　將6孔板上經(jīng)過西達本胺（0、20、4

7、0、80μmol/L）處理48小時的細胞用細胞刮收集到EP管，用裂解液提取蛋白，并用BCA測蛋白濃度。通過跑電泳將目的蛋白與其他蛋白分離開來，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，孵一抗和二抗，再通過顯影劑使目的蛋白顯影。
　　先用Primer Premier軟件設(shè)計引物，由專門公司合成。使用TRIzol提取總mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，再用實時熒光定量PCR儀檢測Ct值，用2-ΔΔCt計算分析結(jié)果。
　

8、　結(jié)果:
　　經(jīng)西達本胺（0，20，40，80，100μM）處理的MCF7和MDA-MB453細胞增殖均被抑制，呈一定的時間和濃度依賴性，在24小時時抑制作用較弱，抑制率都在25%以下；當(dāng)較高濃度西達本胺作用48或72小時，MDA-MB453和MCF7細胞一樣，抑制率都為90%左右。西達本胺作用于乳腺癌細胞后，細胞邊緣變得不規(guī)則，細胞碎片增多，并出現(xiàn)大量的懸浮細胞。2種乳腺癌細胞經(jīng)西達本胺（濃度分別為0、20、40和80μmol/

9、L）處理48小時后，隨著藥物濃度的提高，MCF7和MDA-MB453細胞的凋亡率逐漸增加，分別從3.6±1.04%升至33.03±5.75%和3.07±0.64%升至26.6±6.6%；細胞周期分布中G2/M期也增加的非常明顯，分別從13.45±5.73%升至27.45±8.44%和18.95±1.48%升至34.4±14.67%。實時熒光定量PCR和Western Blot提示西達本胺可明顯下調(diào)兩種乳腺癌細胞Bcl-2、pro-Cas