JMJD2B在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究以及幽門螺桿菌感染對(duì)JMJD2B表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、研究背景：
　　胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，位居全球癌癥相關(guān)的死亡率第二位。雖然胃癌整體發(fā)病率在美國(guó)有所下降，但在亞洲國(guó)家發(fā)生率仍然偏高。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征之一，胃癌一旦進(jìn)入晚期或轉(zhuǎn)移性階段，手術(shù)和聯(lián)合化療對(duì)于提高患者的生存率起效甚微。因此，更透徹地揭示胃癌的發(fā)生及發(fā)展的機(jī)理是當(dāng)務(wù)之急。確定新的診斷和預(yù)后指標(biāo)，尋找新的藥物治療靶點(diǎn)進(jìn)行有針對(duì)性的治療至關(guān)重要。
　　腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜的

2、生物學(xué)過程。其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是啟動(dòng)上皮類型腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，是指上皮細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞間粘附下降，轉(zhuǎn)化為具有遷移特性的間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，是癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。其主要的特征有上皮標(biāo)記細(xì)胞黏附分子(如E-cadherin)表達(dá)下降、β-catenin異常轉(zhuǎn)位和間質(zhì)化標(biāo)記的異常上調(diào)表達(dá)（像Vimentin，N-cadherin等等）。通

3、過EMT，與基底膜正常相互作用的具有極性的、不可活動(dòng)的上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型。因此，EMT是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。
　　JMJD2B，又稱KDM4B，屬于JMJD2蛋白家族，是含有JmjC結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶。JMJD2B主要靶向組蛋白H3第9位賴氨酸的三甲基(H3K9me3)使其發(fā)生去甲基化，

4、在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，如異染色質(zhì)的形成，X染色體失活，同源異型基因沉默和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。近來，表觀遺傳分子JMJD2B在腫瘤發(fā)生中的作用受到越來越多的關(guān)注，JMJD2B在干細(xì)胞分化，炎癥，和多種惡性腫瘤如乳腺癌，胃癌，結(jié)直腸癌，膀胱癌和肺癌的形成中發(fā)揮重要的表觀遺傳學(xué)作用。本實(shí)驗(yàn)組之前研究表明胃癌組織中存在JMJD2B的過度表達(dá)，抑制其活性將抑制胃癌細(xì)胞增殖和存活，參與了胃癌的發(fā)生，但是JMJD2B是否通過EMT進(jìn)程參與了胃癌

5、進(jìn)展以及JMJD2B參與胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制引起了我們極大的興趣。
　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染是導(dǎo)致胃炎、胃潰瘍和胃癌的發(fā)生甚至侵襲轉(zhuǎn)移至關(guān)重要的病原因素。幽門螺桿菌，長(zhǎng)期定植于胃粘膜上皮細(xì)胞，導(dǎo)致宿主發(fā)生慢性萎縮性胃炎、消化道潰瘍，不典型增生乃至胃癌。因此，感染幽門螺桿菌是胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為(Ⅰ)類致癌因子。然而，幽門螺桿菌

6、感染導(dǎo)致的胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中所涉及的分子機(jī)制尚未完全明了。
　　細(xì)菌和病毒引起的組蛋白重塑是促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展的一個(gè)機(jī)制.幽門螺桿菌誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞組蛋白H3K9的二甲基降低，組蛋白去甲基化酶JMJD2B主要靶向組蛋白H3第9位賴氨酸的三甲基(H3K9me3)使其發(fā)生去甲基化調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。因此探討幽門螺桿菌感染對(duì)JMJD2B的表達(dá)影響，不僅更加深入的揭示幽門螺桿菌感染的致癌機(jī)理而且補(bǔ)充了JMJD2B在胃癌的發(fā)生發(fā)

7、展中的作用機(jī)制。
　　研究目的：
　　探討組蛋白去甲基化酶JMJD2B通過促進(jìn)EMT進(jìn)程在胃癌的進(jìn)展過程中的作用和胃癌細(xì)胞中幽門螺桿菌感染對(duì)JMJD2B表達(dá)的調(diào)控作用，并且揭示了JMJD2B參與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制。
　　研究方法和結(jié)果：
　　第一部分、JMJD2B協(xié)同作用β-catenin促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化增強(qiáng)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移具有較強(qiáng)侵襲能力的胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803轉(zhuǎn)染特異性靶向JMJD2B的小干擾

8、RNA封閉JMJD2B的表達(dá)
　　發(fā)現(xiàn)細(xì)胞由疏松的長(zhǎng)梭形間質(zhì)樣表型向緊密的鵝卵石樣的上皮表型轉(zhuǎn)變。這提示JMJD2B可能參與胃癌的EMT進(jìn)程。為研究JMJD2B是否參與胃癌細(xì)胞EMT進(jìn)程， Western blot和Real time PCR方法檢測(cè)敲除JMJD2B，EMT相關(guān)的間質(zhì)化標(biāo)記像vimentin和snail的表達(dá)明顯下調(diào)，而上皮化標(biāo)記E-cadherin的表達(dá)明顯上調(diào)，而過表達(dá)JMJD2B得到同上相反的結(jié)果。由此我們考

9、慮JMJD2B通過調(diào)節(jié)EMT促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步揭示JMJD2B促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT進(jìn)程的機(jī)制，我們用啟動(dòng)子雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了BGC823細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制JMJD2B表達(dá)降低了vimentin啟動(dòng)子VimPro-Luc啟動(dòng)子活性，而對(duì)突變的vimentin啟動(dòng)子VimProMut-Luc（β-catenin/TCF結(jié)合位點(diǎn)失活）啟動(dòng)子活性降低程度減弱，過表達(dá)JMJD2B得到相反的結(jié)果，因此初步推測(cè)JMJD2B是依賴β-cateni

10、n途徑，通過調(diào)節(jié)vimentin啟動(dòng)子活性介導(dǎo)vimentin轉(zhuǎn)錄表達(dá)促進(jìn)EMT進(jìn)程。免疫共沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀方法檢測(cè)JMJD2B物理性的結(jié)合β-catenin，被招募到vimentin啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄激活vimentin表達(dá)從而調(diào)節(jié)EMT，進(jìn)一步證實(shí)了上述機(jī)制。不僅如此，免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示敲除JMJD2B能減弱TGF-β介導(dǎo)的β-catenin的核聚集抑制vimentin轉(zhuǎn)錄，更進(jìn)一步揭示了JMJD2B調(diào)節(jié)EMT進(jìn)程的機(jī)制。我們通過通過創(chuàng)

11、傷劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制JMJD2B的表達(dá)后，HGC27和MGC803細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力明顯減弱，從體外水平證明了JMJD2B與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。裸鼠尾靜脈注射JMJD2B敲除的胃癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型從體內(nèi)水平檢測(cè)JMJD2B對(duì)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。我們使用101例胃癌組織標(biāo)本通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)JMJD2B和vimentin表達(dá)水平，結(jié)果表明，JMJD2B的表達(dá)和胃癌的大小(P=0.017)，分化

12、程度(P=0.002)，腫瘤的侵襲(P=0.045)，淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)(P=0.000)，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(P=0.024)，TNM分期(P=0.002)和vimentin表達(dá)(P=0.004)相關(guān)。
　　第二部分、幽門螺桿菌感染對(duì)JMJD2B表達(dá)的調(diào)控作用
　　在本實(shí)驗(yàn)中，我們用Western blot和Real time PCR方法檢測(cè)幽門螺桿菌26695菌株感染胃癌細(xì)胞（細(xì)菌:細(xì)胞=100∶1）0.5，1，1.5和2h， JM

13、JD2B表達(dá)上調(diào)，同時(shí)COX-2的表達(dá)也隨之上調(diào)。靶向JMJD2B的siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，抑制JMJD2B表達(dá)后再用幽門螺桿菌感染細(xì)胞，JMJD2B又升高，同時(shí)還伴隨著COX-2蛋白表達(dá)也上調(diào)，為更進(jìn)一步研究JMJD2B在幽門螺桿菌感染下調(diào)控JMJD2B的表達(dá)促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，胃癌細(xì)胞抑制JMJD2B表達(dá)，COX-2也隨之表達(dá)下調(diào)，證明JMJD2B在幽門螺桿菌誘導(dǎo)下正性調(diào)控COX-2，這與原發(fā)性胃癌標(biāo)本免疫組化的結(jié)果相吻合: