MiRNa-491-5p通過靶向JMJD2B抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移并作為潛在胃癌診斷標記物的研究.pdf

1、研究背景
　　胃癌(Gastric cancer)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。近些年來，雖然胃癌的發(fā)病率有所下降但其死亡率一直居高不下，成為困擾人類健康的重大難題。從全世界范圍來看，胃癌在亞洲地區(qū)的發(fā)病率最高，在中國位居癌癥發(fā)病率的第二位。由于現(xiàn)有的胃癌診斷標志物缺乏靈敏性和可靠性以及胃癌早期臨床指征不明顯，大多數(shù)胃癌患者一旦確診已是晚期，胃癌患者的五年生存率較低。因而，尋找新的診斷和治療胃癌的靈敏性和特異性高的的靶點成為當務

2、之急。
　　本課題組之前研究發(fā)現(xiàn)JMJD2B(KDM4B)，即組蛋白去甲基化酶在胃癌組織中高表達，具有促進胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的能力。然而，在胃癌發(fā)生發(fā)展的過程中，JMJD2B的調控機制尚未完全闡明。研究表明，miRNAs是單鏈非編碼的RNA分子，可以在轉錄后水平調節(jié)細胞的一系列生物學功能，包括調控細胞周期以及細胞增殖、分化、凋亡、代謝的進程等。因而miRNA的異常表達能夠誘導腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。鑒于此我們推測JMJD2B是否能

3、受到miRNA的調控而參與胃癌的發(fā)生發(fā)展進程。我們通過生物信息學分析軟件預測可以調控JMJD2B表達的miRNA分子，并通過一系列的細胞分子生物學實驗驗證了miR-491-5p可以調控JMJD2B的表達，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。此外，我們通過檢測組織和血清中miR-491-5p的表達發(fā)現(xiàn)，miR-491-5p可能作為胃癌早期診斷的標志物。
　　實驗目的
　　探討在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中miR-491-5p調控JMJD2B的分子機

4、制，以及miR-491-5p作為胃癌診斷標志物的潛在價值。
　　實驗方法
　　1、以JMJD2B為靶基因，通過四種生物信息學軟件(miRDB、miRanda/microRNA.org、Microcosm Targets和DIANA-microT v3.0)預測能結合在JMJD2B3' UTR端的潛在miRNA，綜合分析后挑選出miR-491-5p作為研究分子。利用QRT-PCR檢測不同的胃癌細胞系(BGC823、 MGC80

5、3、SGC7901和HGC27)中miR-491-5p的表達水平差異。將化學合成的miR-491-5p mimics和miR-mimics control利用轉染效率較高的脂質體Lipofectamine2000，分別轉染胃癌細胞系MGC803和SGC7901，用QRT-PCR檢測miRNA的轉染效率。在胃癌細胞系中轉染miR-491-5p模擬物后使用Western blot方法，檢測miRNA靶向的JMJD2B在蛋白水平的變化。

6、>　　2、利用雙熒光素酶報告基因實驗將JMJD2B3'UTR野生型載體pmiR-RB-REPORT_h-KDM4B WT或 JMJD2B3'UTR突變型載體pmiR-RB-REPORT_h-KDM4B MUT與miR-491-5p mimics或miR-negativecontrol mimics共同轉染至胃癌細胞系MGC803，檢測雙熒光素酶活性，以驗證miR-491-5p能否結合在JMJD2B3' UTR端。
　　3、將miR

7、-49 l-5p mimics和miR-negative control mimics分別轉染胃癌細胞系MGC803和SGC7901，利用克隆形成實驗檢測轉染miR-491-5p mimics后對胃癌細胞系克隆形成能力的影響;利用Transwell基質膠實驗檢測轉染miR-491-5p mimics后對胃癌細胞系侵襲能力的影響;利用劃痕實驗檢測轉染miR-491-5p mimics后對胃癌細胞系遷移能力的影響。
　　4、利用QRT

8、-PCR檢測miR-491-5p在胃癌組織以及胃癌患者血清標本中的表達，評估其是否能作為胃癌的潛在診斷標志物。
　　5、利用QRT-PCR檢測幽門螺桿菌菌株感染胃癌細胞系后miR-491-5p表達水平變化。
　　實驗結果
　　1、四種生物信息學分析軟件(miRDB、miRanda/microRNA.org、MicrocosmTargets和DIANA-microT v3.0)預測結果顯示，miR-491-5p可以結合在

9、JMJD2B3' UTR端。QRT-PCR檢測結果顯示，miR-491-5p在惡性程度比較高的胃癌細胞系BGC823、 MGC803、SGC7901和HGC27中的表達水平相比在GES-1（永生化的胃上皮細胞系）中的表達明顯下降，實驗結果有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);將miR-491-5p mimics轉染胃癌細胞系MGC803和SGC7901，與轉染對照組相比，實驗組中miR-491-5p表達量明顯增高(P＜0.001);將miR-

10、491-5p mimics轉染胃癌細胞系MGC803和SGC7901后，Western blot結果顯示JMJD2B的蛋白水平表達降低，檢測結果有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　2、通過生物信息學分析軟件TargetScan預測結果顯示miR-491-5p在JMJD2B3' UTR端有三個結合位點，因此我們構建了包含JMJD2B3' UTR的如下載體:JMJD2B3' UTR的野生型載體，三個位點的總突變載體以及三個位點的單突變

11、載體。使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，與對照組檢測相比，pmiR-RB-REPORT_h-KDM4B WT與miR-491-5p mimics共同轉染胃癌細胞系后，胃癌細胞系的熒光素酶活性明顯下降(P＜0.05);而當miR-491-5p mimics與三個位點的總突變載體共轉染后，熒光素酶活性未出現(xiàn)明顯下降;同時，三個單突變載體分別與miR-491-5p mimics共同轉染胃癌細胞系后，熒光素酶活性未出現(xiàn)明顯變化，以上結果表明miR

12、-491-5p能夠直接結合于JMJD2B3'UTR端，同時三個結合位點在miR-491-5p對JMJD2B的調控中都發(fā)揮作用。
　　3、檢驗胃癌細胞系的克隆形成實驗結果顯示，當轉染miR-491-5p mimics后胃癌細胞系的克隆形成能力顯著受到抑制(P＜0.05);Transwell基質膠實驗結果表明轉染miR-491-5p mimics能夠降低胃癌細胞系的侵襲能力(P＜0.05);細胞劃痕實驗結果顯示轉染miR-491-5p

13、 mimics后能抑制胃癌細胞系的遷移能力(P＜0.05)。
　　4、QRT-PCR檢測結果顯示JMJD2B在胃癌組織中的表達比癌旁正常組織的表達量升高，而miR-491-5p在胃癌組織中相比正常組織表達量下降;miR-491-5p在胃癌患者血清中表達相比正常人群明顯降低，用ROC曲線評估m(xù)iR-491-5p診斷胃癌的價值，AUC為0.919，95％ CI為0.874-0.963，敏感度為94.2％，特異性為76.2％。