Lgr5在胃癌血管生成中的作用及其分子調(diào)控機制研究.pdf

1、胃癌目前仍是威脅我國人民群眾健康的主要惡性腫瘤之一,其五年生存率不超過40％,轉(zhuǎn)移復發(fā)是導致胃癌患者死亡的主要原因。探尋影響胃癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的分子機制對揭示胃癌發(fā)病機理,提升臨床診治水平十分重要。現(xiàn)有研究表明,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)、轉(zhuǎn)移是多因素、多基因相互協(xié)調(diào)作用的多階段過程,而血管生成在腫瘤生長和復發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用,拮抗血管生成可達到明顯抑制腫瘤生長的效果,尋找并確定新的抗腫瘤血管生成靶點,一直以來都是腫瘤研究的熱點和方向。

2、>　　Lgr5又名GPR49,近年來研究表明,Lgr5無論作為胃腸道、毛囊等成體干細胞標記物,還是結(jié)直腸癌、膠母細胞瘤等腫瘤干細胞標記,均較既往的標記物CD133、CD44更具特異性。前期,我們在回顧性研究中發(fā)現(xiàn),Lgr5蛋白與血管生成相關因子表達間具有正相關關系,提示Lgr5可能在胃癌血管生成過程扮演了重要角色,但其具體作用位點和調(diào)控機制仍不清楚,探討Lgr5在胃癌血管生成中的作用機理,對于解釋胃癌諸多惡性生物學行為根源,尋找新的抗腫

3、瘤血管生成靶點具有一定的理論和實踐意義。
　　目的:利用Lgr5作為腫瘤組織分子標記物,分析其在胃癌組織中的表達及與預后的相關性,確定其作為預后判斷危險因素的可能性;檢測Lgr5與血管生成相關指標VEGF和MVD之間的關系,分析其與血管生成的可能關系;通過構(gòu)建Lgr5過表達質(zhì)粒,觀察Lgr5過表達對胃癌細胞的增殖、遷徙、凋亡等生物學行為的影響;通過生物信息學分析和免疫學相關技術,探索Lgr5在胃癌血管生成信號通路中的作用位點及調(diào)控

4、形式,為尋找抗腫瘤血管生成新的靶點奠定理論基礎。
　　方法:選取解放軍總醫(yī)院2005-2006年經(jīng)病理證實的115例胃癌患者組織標本,通過免疫組化染色分析Lgr5、CD34、VEGF、P-AKT在胃癌及癌旁正常組織中的表達,及其之間的相關性;構(gòu)建GFP標記的Lgr5過表達重組質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染BGC823胃癌細胞,通過平板克隆、MTT、Transwel實驗檢測Lgr5過表達狀態(tài)下對細胞生長、增殖、遷徙能力影響;通過流式細胞儀和凋亡相關

5、酶Caspase3活性檢測,觀察Lgr5過表達對細胞凋亡的影響;利用生物信息學的手段分析Lgr5與血管生成相關蛋白、基因興趣分子間作用;應用Westernblot方法檢測相關蛋白表達情況;運用貝伐單抗封閉VEGF/VEGFR信號通路,觀察經(jīng)典的血管生成信號通路的下游分子變化情況;通免疫熒光共定位觀察Lgr5與P-AKT間的空間位置關系;運用免疫共沉淀技術檢測候選蛋白間相互作用關系。
　　結(jié)果:胃癌組織中Lgr5的表達與患者預后具有

6、顯著相關性(P<0.05),Lgr5是影響胃癌患者預后風險因子;Lgr5在腫瘤中的表達與血管生成相關指標MVD、VEGF成正相關(P<0.05);成功構(gòu)建PEGF-Lgr5過表達質(zhì)粒,Lgr5過表達可顯著增強胃癌細胞BGC823的生長、增殖、凋亡抵抗和遷徙能力;Lgr5通過Wnt/β-catenin信號通路,促進了TCF/LEF等核轉(zhuǎn)錄因子募集,提升VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄水平,導致VEGF蛋白表達上調(diào),進而促進腫瘤血管生成;同時,VEGF

7、可通過VEGF/VEGFR自分泌通路,持續(xù)活化下游PI3K/AKT信號通路,誘導VEGF表達繼續(xù)上調(diào),進一步促進了腫瘤血管生成;PTEN/PI3K/AKT信號通路的負性調(diào)控作用未見明顯增強,未能有效拮抗血管生成作用;阻斷VEGF/VEGFR信號通路,Lgr5過表達仍可有效激活PI3K/AKT信號通路,促進血管生成;Lgr5可以不依賴VEGF/VEGFR通路,仍然能夠在胞內(nèi)與p-AKT蛋白發(fā)生相互作用,誘導產(chǎn)生非PI3K依賴型激活效應,達

8、到活化PI3K/AKT信號通路目的,促進血管生成。
　　結(jié)論:Lgr5作為新的腫瘤干細胞潛在分子標記物,是判斷胃癌預后的重要風險因子,與胃癌增殖、轉(zhuǎn)移和促進腫瘤血管生成密切相關。Lgr5可通過Wnt/β-catenin—VEGF/VEGFR2(自分泌方式)—PI3K/AKT—VEGF信號調(diào)控網(wǎng)絡發(fā)揮促進腫瘤血管生成作用。封閉VEGF/VEGFR2信號通路,Lgr5仍可有效活化PI3K/AKT/VEGF通路,產(chǎn)生了非PI3K依賴型激