Lgr5在胃癌血管生成中的作用及其分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、胃癌目前仍是威脅我國(guó)人民群眾健康的主要惡性腫瘤之一,其五年生存率不超過(guò)40％,轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是導(dǎo)致胃癌患者死亡的主要原因。探尋影響胃癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制對(duì)揭示胃癌發(fā)病機(jī)理,提升臨床診治水平十分重要?，F(xiàn)有研究表明,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是多因素、多基因相互協(xié)調(diào)作用的多階段過(guò)程,而血管生成在腫瘤生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用,拮抗血管生成可達(dá)到明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果,尋找并確定新的抗腫瘤血管生成靶點(diǎn),一直以來(lái)都是腫瘤研究的熱點(diǎn)和方向。

2、>　　Lgr5又名GPR49,近年來(lái)研究表明,Lgr5無(wú)論作為胃腸道、毛囊等成體干細(xì)胞標(biāo)記物,還是結(jié)直腸癌、膠母細(xì)胞瘤等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記,均較既往的標(biāo)記物CD133、CD44更具特異性。前期,我們?cè)诨仡櫺匝芯恐邪l(fā)現(xiàn),Lgr5蛋白與血管生成相關(guān)因子表達(dá)間具有正相關(guān)關(guān)系,提示Lgr5可能在胃癌血管生成過(guò)程扮演了重要角色,但其具體作用位點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制仍不清楚,探討Lgr5在胃癌血管生成中的作用機(jī)理,對(duì)于解釋胃癌諸多惡性生物學(xué)行為根源,尋找新的抗腫

3、瘤血管生成靶點(diǎn)具有一定的理論和實(shí)踐意義。
　　目的:利用Lgr5作為腫瘤組織分子標(biāo)記物,分析其在胃癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性,確定其作為預(yù)后判斷危險(xiǎn)因素的可能性;檢測(cè)Lgr5與血管生成相關(guān)指標(biāo)VEGF和MVD之間的關(guān)系,分析其與血管生成的可能關(guān)系;通過(guò)構(gòu)建Lgr5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,觀察Lgr5過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、遷徙、凋亡等生物學(xué)行為的影響;通過(guò)生物信息學(xué)分析和免疫學(xué)相關(guān)技術(shù),探索Lgr5在胃癌血管生成信號(hào)通路中的作用位點(diǎn)及調(diào)控

4、形式,為尋找抗腫瘤血管生成新的靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法:選取解放軍總醫(yī)院2005-2006年經(jīng)病理證實(shí)的115例胃癌患者組織標(biāo)本,通過(guò)免疫組化染色分析Lgr5、CD34、VEGF、P-AKT在胃癌及癌旁正常組織中的表達(dá),及其之間的相關(guān)性;構(gòu)建GFP標(biāo)記的Lgr5過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BGC823胃癌細(xì)胞,通過(guò)平板克隆、MTT、Transwel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lgr5過(guò)表達(dá)狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷徙能力影響;通過(guò)流式細(xì)胞儀和凋亡相關(guān)

5、酶Caspase3活性檢測(cè),觀察Lgr5過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;利用生物信息學(xué)的手段分析Lgr5與血管生成相關(guān)蛋白、基因興趣分子間作用;應(yīng)用Westernblot方法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)情況;運(yùn)用貝伐單抗封閉VEGF/VEGFR信號(hào)通路,觀察經(jīng)典的血管生成信號(hào)通路的下游分子變化情況;通免疫熒光共定位觀察Lgr5與P-AKT間的空間位置關(guān)系;運(yùn)用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)候選蛋白間相互作用關(guān)系。
　　結(jié)果:胃癌組織中Lgr5的表達(dá)與患者預(yù)后具有

6、顯著相關(guān)性(P<0.05),Lgr5是影響胃癌患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因子;Lgr5在腫瘤中的表達(dá)與血管生成相關(guān)指標(biāo)MVD、VEGF成正相關(guān)(P<0.05);成功構(gòu)建PEGF-Lgr5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,Lgr5過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞BGC823的生長(zhǎng)、增殖、凋亡抵抗和遷徙能力;Lgr5通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)了TCF/LEF等核轉(zhuǎn)錄因子募集,提升VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄水平,導(dǎo)致VEGF蛋白表達(dá)上調(diào),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成;同時(shí),VEGF

7、可通過(guò)VEGF/VEGFR自分泌通路,持續(xù)活化下游PI3K/AKT信號(hào)通路,誘導(dǎo)VEGF表達(dá)繼續(xù)上調(diào),進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤血管生成;PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控作用未見明顯增強(qiáng),未能有效拮抗血管生成作用;阻斷VEGF/VEGFR信號(hào)通路,Lgr5過(guò)表達(dá)仍可有效激活PI3K/AKT信號(hào)通路,促進(jìn)血管生成;Lgr5可以不依賴VEGF/VEGFR通路,仍然能夠在胞內(nèi)與p-AKT蛋白發(fā)生相互作用,誘導(dǎo)產(chǎn)生非PI3K依賴型激活效應(yīng),達(dá)

8、到活化PI3K/AKT信號(hào)通路目的,促進(jìn)血管生成。
　　結(jié)論:Lgr5作為新的腫瘤干細(xì)胞潛在分子標(biāo)記物,是判斷胃癌預(yù)后的重要風(fēng)險(xiǎn)因子,與胃癌增殖、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)腫瘤血管生成密切相關(guān)。Lgr5可通過(guò)Wnt/β-catenin—VEGF/VEGFR2(自分泌方式)—PI3K/AKT—VEGF信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮促進(jìn)腫瘤血管生成作用。封閉VEGF/VEGFR2信號(hào)通路,Lgr5仍可有效活化PI3K/AKT/VEGF通路,產(chǎn)生了非PI3K依賴型激