溶血磷脂酸參與骨癌痛外周機(jī)制的研究.pdf

1、癌癥是目前醫(yī)學(xué)界最難以治療的疾病之一。癌癥中異常增生的腫瘤細(xì)胞能夠逐步破壞周圍組織和器官的結(jié)構(gòu)與功能,同時產(chǎn)生癌癥痛等癥狀,對病人的生理及心理造成嚴(yán)重的影響。
　　溶血磷脂酸(Lysophosphatidicacid,LPA)是由羥基丙三醇、磷酸鹽基團(tuán)以及長鏈脂肪酸三部分組成的簡單脂類分子。近年來大量的研究報導(dǎo)證明LPA通過LPA1-5五種受體亞型參與了癌癥細(xì)胞的抗凋亡、增殖和轉(zhuǎn)移等活動,是調(diào)控癌癥發(fā)展的重要分子。同時也有研究指出

2、,LPA通過其LPA1受體也參與了外周痛覺信息的傳遞,特別在神經(jīng)病理痛的產(chǎn)生中起到了重要的作用。
　　外周神經(jīng)損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)病理痛是癌癥痛產(chǎn)生的主要機(jī)制之一。然而,作為在癌癥發(fā)展的過程中以及在神經(jīng)病理痛的形成中都起到關(guān)鍵調(diào)控作用的LPA,目前尚無相關(guān)報道證明它是否參與了癌癥痛的產(chǎn)生。因此,本研究工作以大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)接種WALKER256乳腺癌細(xì)胞建立的骨癌痛模型為研究對象,采用行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)以及電生理的方法,觀察了

3、癌細(xì)胞對外周神經(jīng)纖維的影響,以及LPA在形成的骨癌痛中所起的作用,并且進(jìn)一步探討了LPA在參與骨癌痛形成中所涉及的下游信號通路,為癌癥痛的臨床治療提供了可能的理論依據(jù)。
　　1.骨癌模型及相關(guān)行為學(xué)和形態(tài)學(xué)變化
　　臨床骨癌病例最明顯的特征就是骨內(nèi)癌細(xì)胞對骨質(zhì)的破壞,以及產(chǎn)生嚴(yán)重的骨癌痛。骨癌模型動物的X光影像分析表明,在接種腫瘤細(xì)胞16天后,骨癌大鼠的脛骨內(nèi)就已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的骨質(zhì)損傷。脛骨隨著癌癥的發(fā)展會產(chǎn)生明顯的變形,術(shù)

4、后25天后整個骨頭變得非常脆弱,甚至發(fā)生骨折。
　　vonFrey機(jī)械刺激誘導(dǎo)的骨癌痛從術(shù)后第7天開始出現(xiàn),機(jī)械閾值由術(shù)前的15.88±2.36g變?yōu)?.00±1.03g,術(shù)后第16天痛敏達(dá)到最高峰,閾值降低到4.68±0.79g。通過對1g到16g之間不同強(qiáng)度機(jī)械刺激的反應(yīng)情況進(jìn)行對比,骨癌大鼠不僅對能引起正常動物痛行為的高強(qiáng)度機(jī)械刺激(≥15g)產(chǎn)生了痛覺過敏,同時對原本不能引起正常大鼠痛行為的低強(qiáng)度機(jī)械刺激(＜15g)也變得

5、敏感,形成了觸誘發(fā)痛現(xiàn)象,說明骨癌大鼠外周支配皮膚神經(jīng)中的A纖維與C纖維都受到癌癥細(xì)胞的影響發(fā)生了敏化。本研究選擇術(shù)后16天左右的大鼠進(jìn)行進(jìn)一步骨癌痛機(jī)制研究。
　　2.骨癌大鼠的外周神經(jīng)纖維損傷及其電生理特性
　　通過形態(tài)學(xué)和電生理的方法來觀察癌癥細(xì)胞對外周神經(jīng)纖維的影響。免疫組化觀察外周神經(jīng)損傷標(biāo)志物激活轉(zhuǎn)錄因子3(activatingtranscriptionfactor3,ATF3)的表達(dá),結(jié)果顯示在骨癌大鼠術(shù)側(cè)腰4

6、、腰5節(jié)段的背根節(jié)(dorsalrootganglia,DRG)神經(jīng)元胞體中,ATF3表達(dá)量上調(diào)(每片DRG切片ATF3陽性細(xì)胞表達(dá)量比較:骨癌組=14.45,假手術(shù)組=2.02),說明骨癌大鼠外周神經(jīng)纖維上發(fā)生了損傷。
　　大鼠后關(guān)節(jié)囊神經(jīng)與腓腸神經(jīng)分別為支配脛骨骨髓腔和支配小腿及腳掌外側(cè)皮膚的神經(jīng)纖維,它們分別代表了骨內(nèi)神經(jīng)纖維與骨外神經(jīng)纖維。在體記錄骨癌大鼠后關(guān)節(jié)囊神經(jīng)與腓腸神經(jīng)的多單位動作電位發(fā)放,結(jié)果顯示后關(guān)節(jié)囊神經(jīng)受骨

7、內(nèi)腫瘤細(xì)胞直接作用后,平均自發(fā)放電頻率大大降低(骨癌組=O.16Hz,假手術(shù)組=0.97Hz),且對骨髓腔內(nèi)機(jī)械或辣椒素刺激的敏感性也由術(shù)前的100％降低到僅剩28.6％。然而腓腸神經(jīng)在受骨內(nèi)腫瘤細(xì)胞間接影響后,自發(fā)放電頻率顯著升高(骨癌組=0.75Hz,假手術(shù)組=0.28Hz)。
　　通過首次建立的離體腓腸神經(jīng)-腳掌皮膚的電生理實驗進(jìn)一步觀察腫瘤細(xì)胞對外周皮膚神經(jīng)的敏化作用。結(jié)果顯示,在有少部分腓腸神經(jīng)纖維發(fā)生壞死而失去電生理興

8、奮能力的同時,未受損的神經(jīng)纖維興奮性增強(qiáng),其中A纖維與C纖維均表現(xiàn)出更高的自發(fā)放電比例(Acancer=52.11％,Ccancer=28.57％,Asham=33.85％,Csham=22.58％)。
　　這些結(jié)果在進(jìn)一步的證明了行為學(xué)實驗結(jié)果的同時,更說明了骨癌對于其支配范圍內(nèi)神經(jīng)纖維和鄰近的支配區(qū)外神經(jīng)纖維的影響是不一樣的,腫瘤細(xì)胞直接作用于支配區(qū)內(nèi)的神經(jīng)纖維,可能通過機(jī)械壓迫和酶解等手段造成了大量的神經(jīng)纖維壞死:對于支配范

9、圍外的神經(jīng)纖維,腫瘤細(xì)胞則可能通過間接的作用使其產(chǎn)生敏化,從而表現(xiàn)出機(jī)械刺激皮膚引起的痛敏。
　　3.LPA參與骨癌大鼠的外周神經(jīng)纖維敏化
　　LPA是腫瘤細(xì)胞大量釋放的物質(zhì)之一,對癌癥發(fā)展及神經(jīng)損傷都起到重要的調(diào)控作用,因此,我們進(jìn)一步通過分子生物學(xué)及電生理的方法來觀察LPA在腫瘤細(xì)胞引起的外周神經(jīng)敏化中所扮演的角色。
　　Westernblot觀察外周DRG中LPA1受體的表達(dá),結(jié)果顯示骨癌動物DRG的LPA1表達(dá)

10、量上調(diào),說明LPA及其LPA1受體確實參與了癌癥引起的外周神經(jīng)系統(tǒng)的生理性變化。
　　在建立的離體標(biāo)本中,首先清洗掉標(biāo)本中的血液,去除脛骨,從而排除掉血小板和腫瘤細(xì)胞這兩個LPA的主要來源,然后再給予標(biāo)本外源性的LPA,能夠引起腓腸神經(jīng)單纖維上動作電位發(fā)放,且該反應(yīng)在骨癌大鼠中的敏感要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于假手術(shù)大鼠,其中C纖維的變化尤為明顯(骨癌組=81.25％,假手術(shù)組=22.22％)。說明癌癥引起了LPA對于外周神經(jīng)纖維的刺激性增強(qiáng),進(jìn)一

11、步的證明了LPA參與骨癌痛的產(chǎn)生。
　　LPA1受體是LPA表達(dá)于外周神經(jīng)系統(tǒng)中的主要受體亞型,同時有報導(dǎo)指出P物質(zhì)(substanceP,SP)及其受體NK-1參與了LPA引起的疼痛。我們將離體骨癌標(biāo)本提前給予LPA1受體拮抗劑VPC32183或者NK-1受體拮抗劑WIN51708,均能夠抑制LPA誘導(dǎo)的動作電位發(fā)放,說明LPA通過LPA1以及NK-1受體信號通路來參與腫瘤細(xì)胞引起的骨癌痛外周機(jī)制。
　　綜上所述,本研究結(jié)