大鼠骨癌痛外周機制的研究-溶血磷脂酸調(diào)制TRPV1電流及其信號通路分析.pdf

1、癌癥(cancer)，醫(yī)學(xué)術(shù)語亦稱惡性腫瘤(malignant neoplasm)，它是由控制細胞生長增殖的機制失常而引起的疾病。癌細胞除了生長失控外，還會局部侵入周遭正常組織甚至經(jīng)由體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體其他部分，骨是最常見的轉(zhuǎn)移灶之一。骨癌伴隨的疼痛嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。
　　溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是一類具有生物活性的結(jié)構(gòu)簡單的甘油磷脂類物質(zhì)，它普遍存在于所有真核生物的各種

2、組織內(nèi)，具有廣泛的生物學(xué)功能，包括細胞增殖、遷移、心血管功能、傷口愈合、細胞粘連以及調(diào)節(jié)細胞因子的釋放等。目前發(fā)現(xiàn)LPA有五類受體，LPA1-5，它們均為G蛋白偶聯(lián)受體，在外周感覺傳入初級神經(jīng)元背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)細胞上主要表達LPA1受體。近年來的許多報道表明，LPA參與腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，以及神經(jīng)病理痛的產(chǎn)生。然而，尚不清楚LPA是否也參與癌癥痛的產(chǎn)生。
　　辣椒素受體(TRPV1)

3、是一類非選擇性陽離子通道，能被辣椒素、傷害性熱刺激、酸以及多種內(nèi)源性配體所激活而產(chǎn)生內(nèi)向電流。TRPV1是特異表達在傷害性感受器上傳遞疼痛信息的一類重要的信號分子，近年來的研究表明它在骨癌痛中發(fā)揮著重要的作用。TRPV1受體可以被許多炎癥介質(zhì)如緩激肽、趨化因子和P物質(zhì)等所調(diào)制。
　　本論文在大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)接種WALKER256乳腺癌細胞的骨癌痛模型上，應(yīng)用X光檢測、透射電鏡、免疫熒光組織化學(xué)、蛋白免疫印跡、全細胞膜片鉗以及行為學(xué)

4、等實驗技術(shù)，研究了骨癌動物外周形態(tài)學(xué)和行為學(xué)的變化、LPA在骨癌痛形成中的作用、LPA對TRPV1受體的調(diào)制及其可能的信號通路。主要結(jié)果如下：
　　1.骨癌痛模型：行為學(xué)和形態(tài)學(xué)變化
　　1.1.大鼠骨癌痛模型的建立
　　大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)接種WALKER256乳腺癌細胞后，出現(xiàn)了類似臨床的病理特征如機械痛敏、骨質(zhì)損傷和體重下降等系列的行為和形態(tài)學(xué)的變化。在腫瘤接種后的第15天，X光檢測發(fā)現(xiàn)骨癌大鼠術(shù)側(cè)脛骨發(fā)生了嚴(yán)重的骨

5、質(zhì)損傷，骨內(nèi)局部結(jié)構(gòu)缺失，邊緣模糊，骨內(nèi)密度不均勻，關(guān)節(jié)邊緣的骨質(zhì)被明顯地侵蝕和破壞。在此階段，骨癌動物狀態(tài)較差，體形瘦弱，攝食減少，反應(yīng)遲鈍，毛色暗沉，患側(cè)腿很少負(fù)重，輕觸即可引起疼痛。接種16天以后骨癌大鼠狀態(tài)逐漸變差，并開始陸續(xù)死亡。
　　利用von Frey探針測試對骨癌痛的發(fā)展時程進行了檢測。和假手術(shù)動物相比，骨癌動物在接種后的第7天，其機械縮腿反射閾值(Ppaw withdrawl threshold，PWT)有明顯的

6、降低，即出現(xiàn)了機械觸誘發(fā)痛(allodynia)，之后其PWT值持續(xù)降低，接種后第16天降到最低。之后可能由于骨癌的發(fā)展導(dǎo)致骨癌大鼠行動能力受到影響而使PWT值有了回升。
　　1.2.骨癌引起的大鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)的變化
　　通過透射電鏡和免疫熒光組織化學(xué)染色技術(shù)觀察了骨癌大鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)的變化。后關(guān)節(jié)囊神經(jīng)是脛神經(jīng)的一個分支，它支配著脛骨骨麓腔。對接種后第14天的骨癌動物和假手術(shù)動物的后關(guān)節(jié)囊神經(jīng)進行了透射電鏡觀察。結(jié)果顯示，

7、和假手術(shù)動物后關(guān)節(jié)囊神經(jīng)形狀規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整的髓鞘相比，骨癌動物的后關(guān)節(jié)囊神經(jīng)有明顯的脫髓鞘現(xiàn)象，部分神經(jīng)的髓鞘結(jié)構(gòu)已經(jīng)被完全破壞，表明骨癌動物中支配骨髓腔的神經(jīng)纖維受到了明顯的損傷。
　　激活轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcdption factor3，ATF3)是激活轉(zhuǎn)錄因子/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(activating transcription factor/cAMP-responsiveelement bi

8、nding.protein，ATF/CREB)家族的成員之一，通常被用來作為神經(jīng)損傷的神經(jīng)元標(biāo)記物。采用免疫熒光組織化學(xué)觀察了接種后第14天骨癌動物和假手術(shù)動物雙側(cè)腰4-6(lumber4-6，L4-6)節(jié)段的DRG中ATF3的表達。結(jié)果顯示，骨癌動物術(shù)側(cè)L4、5節(jié)段DRG中ATF3的表達明顯上調(diào)，并且和大細胞標(biāo)記物神經(jīng)微絲蛋白200(neurofilament200，NF200)以及肽能小細胞標(biāo)記物降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoni

9、n gene-related peptide，CGRP)均存在大量的共標(biāo)，而與非肽能小細胞標(biāo)記物異凝集素B4(griffonia simplicifolia isolectin B4，IB4)幾乎不存在共標(biāo)。表明骨癌動物術(shù)側(cè)腰4-5節(jié)段DRG中大細胞和肽能小細胞存在大量損傷，而非肽能小細胞則幾乎沒有損傷。
　　2.LPA對骨癌大鼠外周傷害性感受器的作用
　　2.1.LPA1受體表達的上調(diào)及其拮抗劑對骨癌痛的抑制
　　為

10、了研究LPA在骨癌痛中可能發(fā)揮的作用，檢測了接種后第14天骨癌動物術(shù)側(cè)DRG L4-6節(jié)段中LPA1受體表達的變化。蛋白免疫印跡法(westernblot)結(jié)果表明，和假手術(shù)動物相比，接種后第14天骨癌動物術(shù)側(cè)DRG L4-6中LPA1受體表達明顯上調(diào)，提示LPA及其受體LPA1可能參與了骨癌痛的產(chǎn)生。因此，進一步利用LPA1拮抗劑VPC32183研究了LPA1的激活在骨癌痛中的作用。分別在接種前和接種后第2、4、7和9天，通過腰穿給藥

11、(lumberpuncture，i.p.)的方式對骨癌動物鞘內(nèi)給予VPC32183或生理鹽水，作為給藥組和對照組。結(jié)果表明，和對骨癌動物給予生理鹽水相比，鞘內(nèi)給予VPC32183可以部分翻轉(zhuǎn)骨癌動物機械觸誘發(fā)痛和熱痛敏的形成，表明LPA1的激活參與了骨癌痛的產(chǎn)生。
　　2.2.LPA對TRPV1通道活動的增強
　　基于TRPV1受體是傷害性感受器的重要信號分子，為此檢測了骨癌動物DRG中TRPV1受體的變化。利用wester

12、n blot和急性分離的DRG神經(jīng)元的全細胞膜片鉗等實驗技術(shù)分別檢測了接種后第14-16天骨癌動物術(shù)側(cè)DRG中TRPV1受體表達量的變化以及TRPV1電流幅度的變化。結(jié)果表明，和假手術(shù)動物相比，接種后第14-16天骨癌動物術(shù)側(cè)DRG中TRPV1受體的表達明顯上調(diào)。
　　為了降低TRPV1受體對辣椒素的脫敏作用，采用較低濃度(0.5μM)的辣椒素來誘導(dǎo)產(chǎn)生TRPV1電流。將接種后第14-16天的骨癌動物和假手術(shù)動物術(shù)側(cè)L4-6的DR

13、G神經(jīng)元上由0.5μM辣椒素引起的TRPV1電流幅度度進行了比較。由于細胞的個體差異，每個細胞對0.5μM辣椒素引起的電流幅度差異很大，因此，將所有細胞按照其電流幅度的不同分成兩組，電流幅度低于100 pA的為低電流組，電流幅度高于100 pA的為高電流組。結(jié)果表明，和假手術(shù)動物相比，骨癌動物中低電流組和高電流組電流的平均幅度均有顯著上調(diào)。
　　2.3.LPA對TRPV1電流調(diào)制的胞內(nèi)信號通路
　　利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測了

14、LPA1受體和TRPV1受體在DRG神經(jīng)元上的共表達。結(jié)果顯示，LPA1受體和TRPV1受體在DRG神經(jīng)元上存在大量的共表達，這為它們之間可能的相互作用提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。
　　急性分離的DRG神經(jīng)元的全細胞膜片鉗記錄了LPA對TRPV1電流的調(diào)制作用。結(jié)果表明，LPA可以增強0.5μM辣椒素引起的TRPV1電流，這種增強作用呈時間依賴性。在給予LPA一分鐘后，TRPV1電流開始增大，直到給藥后的第3分鐘，電流增到最大，之后電流慢慢

15、減小，第9分鐘回到基礎(chǔ)水平。同時，LPA對TRPV1電流的調(diào)制作用也呈劑量依賴性，分別給予1μM，0.1μM或0.01μM LPA一分鐘后，辣椒素電流分別增加了221±37％，109±19％和58±9％，而0.001μM LPA對TRPV1電流沒有明顯的增強。
　　與正常動物相比，在骨癌動物中，LPA對TRPV1電流的調(diào)制作用更明顯。在假手術(shù)動物中，極低濃度的辣椒素(0.5 nM)不能誘發(fā)內(nèi)向電流，而40％的骨癌動物的背根神經(jīng)節(jié)神

16、經(jīng)元對0.5 nM的辣椒素有反應(yīng)。對0.5 nM的辣椒素?zé)o反應(yīng)的骨癌動物DRG神經(jīng)元中，0.01μM LPA可以誘導(dǎo)0.5 nM的辣椒素產(chǎn)生一個內(nèi)向電流，然而，這種現(xiàn)象在假手術(shù)動物中并沒有發(fā)現(xiàn)，表明LPA在骨癌狀態(tài)下能易化辣椒素電流。
　　進一步研究了LPA調(diào)制TRPV1可能的信號通路。在給予LPA之前，將細胞分別給予LPA1受體拮抗劑VPC32183、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)拮抗劑BIM、PKCε拮

17、抗劑εV1-2、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)拮抗劑H89以及小G蛋白Rho抑制劑BoTXC3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VPC32183、BIM以及εV1-2均可以阻斷LPA對TRPV1電流的增強，而H89和BoTXC3不能影響LPA對TRPV1電流的易化作用。該結(jié)果表明，LPA對TRPV1受體的調(diào)制作用是通過其受體LPA1來完成的，并依賴于其下游PKC信號通路，尤其是PKCε亞型的激活，而PKA和：Rho-Rock通路并不參與