人多發(fā)性骨髓瘤脂肪酸合成酶的表達和作為治療靶位的分子機制研究.pdf

1、人多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種起源于B淋巴細胞的漿細胞異常增生的惡性腫瘤,多發(fā)于中老年人,隨著我國人口的老齡化其發(fā)病率逐年增高.標準劑量化療對MM緩解率低,因腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥,緩解后短期內復發(fā)率高;雖然大劑量化療聯(lián)合造血干細胞移植其完全緩解率可由5﹪升至50﹪,但由于大劑量化療后的耐藥殘余腫瘤細胞影響預后,其遠期效果改善不明顯.因此,探索新的人多發(fā)性骨髓瘤的治療策略非常必要.脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAs)是

2、一種腫瘤代謝性標志抗原,或稱之為一種"代謝癌基因".腫瘤細胞通過激活這種"代謝癌基因"--腫瘤相關性脂肪酸合成酶的過度表達體現(xiàn)了腫瘤細胞生長優(yōu)勢.本研究分四個部分對人多發(fā)性骨髓瘤"代謝癌基因"--脂肪酸合成酶的表達狀態(tài)和作為治療靶位的分子機制方面作了研究. 一、脂肪酸合成酶在人多發(fā)性骨髓瘤中的表達研究用免疫組織化學檢測,27例人多發(fā)性骨髓瘤骨髓標本中,有19例在骨髓涂片上可見骨髓瘤細胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒,為脂肪酸合成酶表達陽性

3、細胞.占檢測標本的70.37﹪,而缺鐵性貧血骨髓涂片,脂肪酸合成酶表達陰性: 用RT-PCR檢測人多發(fā)性骨髓瘤細胞系U266,RPM18226,人多發(fā)性骨髓瘤骨髓標本和健康獻血員PBMNCs中FAS的表達結果發(fā)現(xiàn),人多發(fā)性骨髓瘤細胞系U266,RPM18226均有FAS mRNA的表達, 27例人多發(fā)性骨髓瘤骨髓標本,有22例有FAS mRNA表達,占檢測標本的81.48﹪;而健康獻血員外周血單個核細胞(PBMNCs)中不表達FAS m

4、RNA;用免疫印跡法(western Blot)檢測人多發(fā)性骨髓瘤細胞系,臨床多發(fā)性骨髓瘤骨髓標本脂肪酸合成酶表達結果發(fā)現(xiàn),人多發(fā)性骨髓瘤細胞系U266,RPM18226均有FAS蛋白水平的表達,27例人多發(fā)性骨髓瘤骨髓標本有16例有不同程度的FAS表達,占檢測標本數(shù)的59.25﹪.而健康人外周血單個核細胞(PBMNCs)不表達FAS.我們認為高表達脂肪酸合成酶的MM可以作為MM的一種表型(Phenotype),可能是一個非常重要的潛在

5、的治療靶點. 二、脂肪酸合成酶抑制劑淺藍菌素體外抗人多發(fā)性骨髓瘤作用的研究我們以U266骨髓瘤細胞為模型,用MTT法檢測了淺藍菌素在體外對U266細胞的增殖抑制作用,發(fā)現(xiàn)20ug/ml終濃度的淺藍菌素即能明顯抑制U266細胞的增殖,并呈劑量依賴性.為進一步了解淺藍菌素抑制骨髓瘤細胞增殖的機制,我們用流式細胞儀技術進行了細胞凋亡及細胞周期DNA分析,結果表明淺藍菌素抑制U266細胞增殖的機制是導致了細胞早期凋亡增加,20ug/ml

6、的cerulenin作用于U266細胞12h,細胞早期凋亡率為56.9﹪,晚期凋亡率為3.2﹪, 24h細胞早期凋亡率為69.3﹪,晚期凋亡率為17.6﹪,而對照組為4.3﹪和1.8﹪.細胞周期DNA分析發(fā)現(xiàn)20ug/ml的cerulenin作用于U266 12h,S期從對照組的9.7﹪上升至20.3﹪,24h時S期為29.8﹪,因此,淺藍菌素可使U266細胞的細胞周期阻滯在S期,從而減少進入G-M期細胞數(shù),減少細胞有絲分裂,導致細胞發(fā)

7、生凋亡.本研究結果提示,脂肪酸合成酶抑制劑在體外可通過促進多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡抑制人多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖,有望成為我們治療MM的又一新方法和新途徑. 三、 SuperArray cDNA基因芯片研究淺藍菌素改變多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡相關基因的表達為進一步明確cerulenin引起MM細胞凋亡的分子機制,我們用SuperArraycDNA基因芯片研究了淺藍菌素改變多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡相關基因的表達譜.20ug/ml淺藍菌素處理U26

8、6細胞12h后,與空白組對照,在研究的96個基因中,共有44個細胞凋亡相關基因表達改變較明顯,其中表達上調2倍以上的基因41個,包括細胞外凋亡通路中TNF受體和配體家族的多個成員基因DR3DR5,OX40,CD4.0,HVEM-L,CD30L,4-1BB-L,TNFR2,TNFRSF14表達上調,與其相關的死亡域和死亡效應結構域基因DAPK2,MyD88,CIDE-A,CIDE-B表達上調,對細胞內通路有重要調節(jié)作用的Bcl-2家族成員

9、Bcl-w,Bik,Nip3,HRK,MCL-1基因的表達上調,Caspase9基因表達上調達43倍,Apafl,Caspase3等基因也明顯上調;有3個基因TNFB/LT, CD40L,TRAF2表達下調2倍以上.結果標明,淺藍菌素引起U266細胞的凋亡有死亡受體信號通路和死亡受體非依賴的轉導通路共同參與,有多個與凋亡相關的家族的多個基因成員表達發(fā)生了變化,Caspase 9表達的顯著上調,說明線粒體途徑在凋亡中起了主要作用,TRAF

10、2基因表達的變化提示著細胞核內轉錄因子參與了淺藍菌素引起U266細胞的凋亡,其確切機制還有待進一步研究. 四、天然藥物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和淺藍菌素抗人多發(fā)性骨髓瘤作用及細胞凋亡相關基因的表達譜的差異性比較綠茶提取物--表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin galIate,EGCG)處理不同的腫瘤細胞系,均顯示有較強的抑制腫瘤細胞增殖的效應,有學者認為它的抗腫瘤作用與它有強大的抑制脂肪酸合成

11、酶的功能相關. 本部分研究對天然藥物EGCG抑制人多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖及誘發(fā)凋亡作用及機制進行研究,并用SuperArrav cDNA基因芯片對EGGG和淺藍菌素抗人多發(fā)性骨髓瘤作用及細胞凋亡相關基因的表達譜進行比較,我們用MTT法檢測了EGCG在體外對U266細胞的增殖抑制作用,發(fā)現(xiàn)50ug/mI終濃度的EGCG即能明顯抑制U266的增殖,并呈劑量依賴性.為進一步了解EGCG抑制骨髓瘤細胞增殖的機制,我們用流式細胞儀技術進行了

12、細胞凋亡及細胞周期DNA分析,結果表明EGCG抑制U266細胞增殖的機制是導致了細胞晚期凋亡增加,而淺藍菌素處理U266細胞相同時間后,U266細胞的凋亡以早期凋亡為主.SuperArray cDNA基因芯片研究結果發(fā)現(xiàn),U266經(jīng)EGCG處理后,與凋亡相關的96個基因中共有56個基因發(fā)生表達變化,其中有51個基因表達上調2倍以上,有5個基因表達下調2倍以上:在表達上調的基因中淺藍菌素組和EGCG組均上調的基因有31個,其中26個基因表

13、達幅度相近,而有4個基因上調幅度有較大差異,Caspase 9、Myd88在淺藍菌素組表達上調水平與EGCG組比較差異在2倍以上,Nip3、Casper(CFLAR)在EGCG組表達上調水平與淺藍菌素組比較差異在2倍以上;在淺藍菌素組表達上調而在EGCG組表達無變化的基因有6個,為Bnice、CRADD、DFF40(CAD)、GADD45、MdM2、TNFA;在EGCG組表達上調而在淺藍菌素組表達無變化的基因有5個,為BAx、4-lBB

14、、Trail、TNFSF-11、TRAF6.研究結果表明,EGGG和淺藍菌素引起U266細胞凋亡均有死亡受體信號通路和死亡受體非依賴的轉導通路共同參與,其中有多個與凋亡相關的家族的多個基因成員表達發(fā)生變化,但兩者在引起凋亡的時間、強度和分子機制上存在一定差異. 1.脂肪酸合成酶在人多發(fā)性骨髓瘤細胞系RPMI8226、U266中高表達,多數(shù)臨床標本有不同程度的脂肪酸合成酶表達. 2.脂肪酸合成酶抑制劑在體外可抑制人多發(fā)性骨

15、髓瘤細胞增殖,有望成為我們治療MM的又一新方法和新途徑. 3.淺藍菌素引起 U266細胞的凋亡有死亡受體信號通路和死亡受體非依賴的轉導通路共同參與,線粒體途徑在凋亡中起了主要作用,細胞核內轉錄因子可能參與了淺藍菌素引起U266細胞的凋亡. 4.EGCG和淺藍菌素引起U266細胞凋亡過程中有多個與凋亡相關的家族的多個基因成員表達發(fā)生相似變化,但兩者在引起凋亡的時間、強度和分子機制上存在一定差異,EGCG的抗多發(fā)性骨髓瘤可能