PYK2在CCR7調(diào)控的頭頸鱗癌的侵襲和遷移中的作用的研究.pdf

1、療的研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：
　　 SCCHN組織標(biāo)本：60例頭頸鱗癌原發(fā)灶和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶樣本及10例癌旁正常口腔黏膜組織樣本。患者術(shù)前均未接受過任何化學(xué)或放射治療。福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織切片常規(guī)進(jìn)行HE染色，分別由兩名病理醫(yī)師診斷，進(jìn)行臨床病理分期。60例SCCHN中包括：腫瘤直徑≤4cm者49例，直徑>4cm者11例，臨床病理分期顯示Ⅰ-Ⅱ期28例，Ⅲ-Ⅳ期32例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴

2、結(jié)轉(zhuǎn)移30例。
　　 細(xì)胞系：人CCR7高表達(dá)頭頸部鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PCI-37B(由匹茲堡大學(xué)腫瘤研究所惠贈(zèng))。
　　 免疫組化染色：SP法檢測(cè)頭頸鱗癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶和無轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及癌旁正常組織的PYK2蛋白表達(dá)情況。組織切片常規(guī)脫蠟并水化。染色步驟簡(jiǎn)述如下：0.1mol/L Tris-HCI(pH10.0)緩沖液，高溫高壓修復(fù)抗原2.5min；3％H2O2和5%山羊血清

3、37℃下分別孵育切片1h；-抗(兔多克隆抗PYK2抗體，1:200稀釋)4℃孵育過夜；山羊抗兔IgG和SP復(fù)合物37℃分別孵育切片30min；最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。兩名病理診斷醫(yī)師分別對(duì)組織切片染色情況進(jìn)行評(píng)分。胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細(xì)胞。至少5個(gè)高倍視野下(400×)評(píng)價(jià)PYK2染色細(xì)胞百分比：細(xì)胞無染色或染色<10%=(-)，11-50%=(+)，51-75%=(++)，>76%=(+++)。
　　 趨化實(shí)驗(yàn)

4、：采用Transwell趨化小室法檢測(cè)。將加入不同處理因素的細(xì)胞消化離心后計(jì)數(shù)，在趨化小室的下室加600μl低糖DMEM，內(nèi)含0.5%BSA及500ng/mlCCL19，將1×106/ml細(xì)胞接種于趨化小室的上室200μl，以無CCL19刺激的正常細(xì)胞為空白對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。24小時(shí)后結(jié)晶紫染色，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。
　　 侵襲實(shí)驗(yàn)：在趨化小室的多聚碳酸脂膜上預(yù)先鋪入1:8稀釋的Mat

5、rigel基質(zhì)膠，4℃風(fēng)干。趨化小室在孵育箱中作用時(shí)間延長(zhǎng)至36小時(shí)。其他步驟同趨化實(shí)驗(yàn)。
　　 Western blot實(shí)驗(yàn)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞饑餓24小時(shí)，細(xì)胞進(jìn)行分組處理后，采用含有PMSF和磷酸酶抑制劑混合物的M-PER(PIERCE)蛋白提取試劑提取細(xì)胞蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度，上樣總蛋白為80μg。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗IgG37℃孵育2小時(shí)，最后酶顯法，顯

6、色劑顯色。ImageJ軟件用于半定量分析特異性條帶的光密度值，將目的蛋白與β-actin光密度比值作為相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。
　　 免疫熒光實(shí)驗(yàn)：PCI-37B細(xì)胞經(jīng)過不同處理后，經(jīng)過戊二醛固定，透膜和TRITC標(biāo)志的鬼筆環(huán)肽染色。每步之間PBS沖洗2遍，每次10分鐘，最后再用PBS沖洗2遍后用熒光電子顯微鏡進(jìn)行觀察。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)四到五次，以取得最佳結(jié)果。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件用于

7、數(shù)據(jù)分析處理。PYK2表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系用X2檢驗(yàn)，p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他實(shí)驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，結(jié)果用mean士sd表示，p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、PYK2在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸鱗癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶高表達(dá)
　　 通過免疫組化實(shí)驗(yàn)，我們檢測(cè)了PYK2在頭頸鱗癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及正?？谇火つさ谋磉_(dá)情況。PYK2主要表達(dá)于腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

8、的原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，而在無轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶低表達(dá)，在正常的口腔黏膜和非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)低表達(dá)或無表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：PYK2表達(dá)與頭頸鱗癌的臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者的年齡及腫瘤大小無關(guān)。
　　 2、PYK2的活化與CCL19誘導(dǎo)的頭頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞PCI-37B的趨化和侵襲能力相關(guān)
　　 應(yīng)用PYK2抑制劑tyrphostin A9和CCR7抗體對(duì)PCI-37B細(xì)胞進(jìn)行處理后，通過趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

9、細(xì)胞的趨化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與無誘導(dǎo)劑的空白對(duì)照組相比，CCL19誘導(dǎo)可顯著增強(qiáng)細(xì)胞的趨化能力。PYK2抑制劑tyrphostin A9和CCR7抗體可顯著降低CCR7介導(dǎo)的PCI-37B細(xì)胞趨化能力。我們進(jìn)一步研究了CCL19誘導(dǎo)的頭頸鱗癌細(xì)胞的侵襲能力，與對(duì)照組比，CCL19顯著增強(qiáng)頭頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞PCI-37B的侵襲能力，而tyrphostin A9明顯抑制CCL19誘導(dǎo)的癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　 3、頭頸鱗癌淋巴

10、結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞PCI-37B中CCR7在PYK2活化中的作用
　　 已有研究發(fā)現(xiàn)PYK2蛋白參與趨化因子受體介導(dǎo)的信號(hào)通路，所以我們研究在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸鱗癌細(xì)胞中PYK2是否參與CCR7介導(dǎo)的信號(hào)通路。應(yīng)用CCL19處理細(xì)胞不同時(shí)間，之后應(yīng)用western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-PYK2(Tyr402)的蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用CCL19(200ng/ml)刺激PCI-37B細(xì)胞2分鐘即出現(xiàn)PYK2的磷酸化，5-10分鐘p-PYK

11、2達(dá)最大值，60分鐘后回到基態(tài)水平。應(yīng)用CCR7抗體或tyrphostin A9對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，應(yīng)用CCL19(200ng/ml)處理細(xì)胞10分鐘后檢測(cè)p-PYK2的蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與無抑制劑組相比p-PYK2的蛋白表達(dá)量顯著減少。
　　 4、CCR7通過PYK2抑制PCI-37B細(xì)胞cofilin的失活
　　 Cofilin蛋白活化可使細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白邊緣聚集，細(xì)胞形成偽足，促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。Cofilin的ser-3磷

12、酸化是其失活狀態(tài)。我們分析cofilin是否參與PYK2介導(dǎo)的信號(hào)通路。Western blot結(jié)果顯示：CCL19抑制PCI-37B細(xì)胞cofilin的磷酸化，即CCL19使cofilin保持活化狀態(tài)，利于細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。Tyrphostin A9預(yù)處理的細(xì)胞與未經(jīng)過預(yù)處理的細(xì)胞相比，cofilin的ser-3磷酸化顯著增加，即PYK2抑制劑明顯抑制cofilin的活化。因此，我們認(rèn)為CCR7通過PYK2調(diào)控cofilin的活化。

13、　　 5、CCR7通過PYK2介導(dǎo)PCI-37B細(xì)胞骨架的重組
　　 細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過程需要細(xì)胞骨架蛋白的參與，我們通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在無CCL19誘導(dǎo)情況下，F(xiàn)-actin主要分布于核周，且呈均勻彌散狀態(tài)。應(yīng)用CCL19誘導(dǎo)后PCI-37B細(xì)胞F-actin表達(dá)增加，并且向邊緣聚集成束，細(xì)胞絲狀偽足增加。應(yīng)用tyrphostin A9預(yù)處理的細(xì)胞在加入CCL19后與無誘導(dǎo)劑相比無明顯變化。這一結(jié)果表明PYK2參與CCR7介導(dǎo)