PYK2在CCR7調(diào)控的頭頸鱗癌的侵襲和遷移中的作用的研究.pdf

1、療的研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：
　　 SCCHN組織標本：60例頭頸鱗癌原發(fā)灶和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶樣本及10例癌旁正常口腔黏膜組織樣本。患者術(shù)前均未接受過任何化學或放射治療。福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織切片常規(guī)進行HE染色，分別由兩名病理醫(yī)師診斷，進行臨床病理分期。60例SCCHN中包括：腫瘤直徑≤4cm者49例，直徑>4cm者11例，臨床病理分期顯示Ⅰ-Ⅱ期28例，Ⅲ-Ⅳ期32例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴

2、結(jié)轉(zhuǎn)移30例。
　　 細胞系：人CCR7高表達頭頸部鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞系PCI-37B(由匹茲堡大學腫瘤研究所惠贈)。
　　 免疫組化染色：SP法檢測頭頸鱗癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶和無轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及癌旁正常組織的PYK2蛋白表達情況。組織切片常規(guī)脫蠟并水化。染色步驟簡述如下：0.1mol/L Tris-HCI(pH10.0)緩沖液，高溫高壓修復抗原2.5min；3％H2O2和5%山羊血清

3、37℃下分別孵育切片1h；-抗(兔多克隆抗PYK2抗體，1:200稀釋)4℃孵育過夜；山羊抗兔IgG和SP復合物37℃分別孵育切片30min；最后DAB顯色，蘇木素復染細胞核。兩名病理診斷醫(yī)師分別對組織切片染色情況進行評分。胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細胞。至少5個高倍視野下(400×)評價PYK2染色細胞百分比：細胞無染色或染色<10%=(-)，11-50%=(+)，51-75%=(++)，>76%=(+++)。
　　 趨化實驗

4、：采用Transwell趨化小室法檢測。將加入不同處理因素的細胞消化離心后計數(shù)，在趨化小室的下室加600μl低糖DMEM，內(nèi)含0.5%BSA及500ng/mlCCL19，將1×106/ml細胞接種于趨化小室的上室200μl，以無CCL19刺激的正常細胞為空白對照組，每組3個復孔。24小時后結(jié)晶紫染色，隨機選取5個高倍視野計數(shù)遷移細胞數(shù)。實驗重復三次，取平均值。
　　 侵襲實驗：在趨化小室的多聚碳酸脂膜上預先鋪入1:8稀釋的Mat

5、rigel基質(zhì)膠，4℃風干。趨化小室在孵育箱中作用時間延長至36小時。其他步驟同趨化實驗。
　　 Western blot實驗：對數(shù)生長期的細胞饑餓24小時，細胞進行分組處理后，采用含有PMSF和磷酸酶抑制劑混合物的M-PER(PIERCE)蛋白提取試劑提取細胞蛋白?？捡R斯亮藍法檢測蛋白濃度，上樣總蛋白為80μg。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗IgG37℃孵育2小時，最后酶顯法，顯

6、色劑顯色。ImageJ軟件用于半定量分析特異性條帶的光密度值，將目的蛋白與β-actin光密度比值作為相對表達量。實驗至少重復3次，取平均值。
　　 免疫熒光實驗：PCI-37B細胞經(jīng)過不同處理后，經(jīng)過戊二醛固定，透膜和TRITC標志的鬼筆環(huán)肽染色。每步之間PBS沖洗2遍，每次10分鐘，最后再用PBS沖洗2遍后用熒光電子顯微鏡進行觀察。重復上述實驗四到五次，以取得最佳結(jié)果。
　　 統(tǒng)計學分析：SPSS13.0統(tǒng)計軟件用于

7、數(shù)據(jù)分析處理。PYK2表達與臨床病理因素的關(guān)系用X2檢驗，p<0.05為有統(tǒng)計學意義。其他實驗采用t檢驗，結(jié)果用mean士sd表示，p<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、PYK2在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸鱗癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶高表達
　　 通過免疫組化實驗，我們檢測了PYK2在頭頸鱗癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及正常口腔黏膜的表達情況。PYK2主要表達于腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞的細胞質(zhì)。在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

8、的原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中高表達，而在無轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶低表達，在正常的口腔黏膜和非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)低表達或無表達。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示：PYK2表達與頭頸鱗癌的臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者的年齡及腫瘤大小無關(guān)。
　　 2、PYK2的活化與CCL19誘導的頭頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞PCI-37B的趨化和侵襲能力相關(guān)
　　 應(yīng)用PYK2抑制劑tyrphostin A9和CCR7抗體對PCI-37B細胞進行處理后，通過趨化實驗檢測

9、細胞的趨化能力。實驗結(jié)果顯示：與無誘導劑的空白對照組相比，CCL19誘導可顯著增強細胞的趨化能力。PYK2抑制劑tyrphostin A9和CCR7抗體可顯著降低CCR7介導的PCI-37B細胞趨化能力。我們進一步研究了CCL19誘導的頭頸鱗癌細胞的侵襲能力，與對照組比，CCL19顯著增強頭頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞PCI-37B的侵襲能力，而tyrphostin A9明顯抑制CCL19誘導的癌細胞的侵襲能力。
　　 3、頭頸鱗癌淋巴

10、結(jié)轉(zhuǎn)移細胞PCI-37B中CCR7在PYK2活化中的作用
　　 已有研究發(fā)現(xiàn)PYK2蛋白參與趨化因子受體介導的信號通路，所以我們研究在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸鱗癌細胞中PYK2是否參與CCR7介導的信號通路。應(yīng)用CCL19處理細胞不同時間，之后應(yīng)用western blot實驗檢測p-PYK2(Tyr402)的蛋白表達量。實驗結(jié)果顯示用CCL19(200ng/ml)刺激PCI-37B細胞2分鐘即出現(xiàn)PYK2的磷酸化，5-10分鐘p-PYK

11、2達最大值，60分鐘后回到基態(tài)水平。應(yīng)用CCR7抗體或tyrphostin A9對細胞進行預處理，應(yīng)用CCL19(200ng/ml)處理細胞10分鐘后檢測p-PYK2的蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)與無抑制劑組相比p-PYK2的蛋白表達量顯著減少。
　　 4、CCR7通過PYK2抑制PCI-37B細胞cofilin的失活
　　 Cofilin蛋白活化可使細胞的肌動蛋白邊緣聚集，細胞形成偽足，促進細胞的運動。Cofilin的ser-3磷

12、酸化是其失活狀態(tài)。我們分析cofilin是否參與PYK2介導的信號通路。Western blot結(jié)果顯示：CCL19抑制PCI-37B細胞cofilin的磷酸化，即CCL19使cofilin保持活化狀態(tài)，利于細胞的運動。Tyrphostin A9預處理的細胞與未經(jīng)過預處理的細胞相比，cofilin的ser-3磷酸化顯著增加，即PYK2抑制劑明顯抑制cofilin的活化。因此，我們認為CCR7通過PYK2調(diào)控cofilin的活化。

13、　　 5、CCR7通過PYK2介導PCI-37B細胞骨架的重組
　　 細胞的運動過程需要細胞骨架蛋白的參與，我們通過免疫熒光實驗，發(fā)現(xiàn)在無CCL19誘導情況下，F(xiàn)-actin主要分布于核周，且呈均勻彌散狀態(tài)。應(yīng)用CCL19誘導后PCI-37B細胞F-actin表達增加，并且向邊緣聚集成束，細胞絲狀偽足增加。應(yīng)用tyrphostin A9預處理的細胞在加入CCL19后與無誘導劑相比無明顯變化。這一結(jié)果表明PYK2參與CCR7介導