Proline-Rich Tyrosine Kinase 2(PYK2)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者發(fā)病機(jī)制和治療中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 富含脯氨酸的非受體酪氨酸激酶(Proline-Rich Tyrosine Kinase2,PYK2)和粘著斑激酶(FAK)同屬于粘著斑激酶家族成員,二者具有相同的結(jié)構(gòu)域和很高的序列相似性。PYK2的多肽鏈包含三個結(jié)構(gòu)域,即 N末端結(jié)構(gòu)域、中央酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和 C末端結(jié)構(gòu)域。N末端結(jié)構(gòu)域包含一個受體結(jié)合域,該結(jié)構(gòu)域可與酪氨酸激酶受體如 EGF受體(EGFR)及細(xì)胞骨架蛋白如埃茲蛋白(Ezrin)等結(jié)合。C末

2、端結(jié)構(gòu)域包含兩個富含脯氨酸的區(qū)域:(aa712-713)和(aa876-877),其中PXXPK、PXXLG基序是SH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn),分別結(jié)合含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白,如p130cas,Graf,PI3K,Hic-5,paxillin等。中央酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域包含三個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)402,579,580(Tyr402,Tyr579,Tyr580),是PYK2的活性部位,其中,Tyr402可以發(fā)生自動磷酸化,磷酸化的Tyr402可與含有

3、SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),如Src,Ab1等結(jié)合,Src與Tyr402結(jié)合并被磷酸化而活化,活化后的Src反過來磷酸化PYK2的其它磷酸化位點(diǎn),使PYK2活性進(jìn)一步增強(qiáng)。故PYK2蛋白活化的標(biāo)志是其402位點(diǎn)的磷酸化。
　　 PYK2分布在神經(jīng)系統(tǒng)和造血來源的細(xì)胞,可以感受包括細(xì)胞外基質(zhì)在內(nèi)的多種物理和化學(xué)的細(xì)胞外信號而激活,活化后的PYK2作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游調(diào)節(jié)分子,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(PI3K、MAPK、J

4、AK/STAT途徑)參與胞內(nèi)信號傳遞,從而在細(xì)胞粘附、遷移、生存、增殖、凋亡、分化等生理過程中發(fā)揮重要作用。由于PYK2主要在造血系統(tǒng)來源的細(xì)胞表達(dá),因此PYK2對淋巴細(xì)胞功能的影響更為重要。活化后的PYK2參與免疫細(xì)胞形態(tài)的維持和細(xì)胞遷移、調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的活性和增值、擴(kuò)增淋巴細(xì)胞表面多種受體信號。由此可見,PYK2途徑的活化是多種細(xì)胞外信號促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化的一條重要通路。
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡是最具代表性的多系統(tǒng)受累的自身免疫性

5、炎性疾病,其主要特征是自身反應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞的異?；罨投喾N自身抗體的出現(xiàn)。SLE發(fā)病機(jī)理仍然不清楚,但多種細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、整合素以及外界物理化學(xué)刺激(如紫外線、某些藥物等)的調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致的T、B淋巴細(xì)胞異?；罨?是SLE發(fā)病機(jī)制的一個必然環(huán)節(jié),并且已經(jīng)成為治療SLE的靶目標(biāo)。
　　 目前研究已經(jīng)證實(shí),和PYK2同一家族的成員FAK介導(dǎo)的整合素β1信號促進(jìn)了SLE患者T淋巴細(xì)胞共刺激分子 CD40L的表達(dá)和T淋巴

6、細(xì)胞的活化。既往研究也表明,PYK2的異?；罨皩?xì)胞內(nèi)多條信號途徑的失調(diào)控反應(yīng)是造成細(xì)胞異常生長、分化或遷移的重要因素,參與了多種腫瘤、血管疾病和急慢性炎癥,特別是有免疫因素參與的炎癥的病理生理過程。鑒于PYK2信號分子在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞活化中的重要作用以及淋巴細(xì)胞的異?；罨赟LE發(fā)病機(jī)制中的重要地位,我們推測PYK2可能通過干擾淋巴細(xì)胞的異?；罨鴧⑴c了SLE的發(fā)病。但是PYK2信號途徑的活化在SLE的研究國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道極少,本研究將

7、通過測定SLE患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)PYK2蛋白和磷酸化水平探討PYK2的活化；通過測定促進(jìn)或阻斷PYK2活化后對SLE患者PBMCs共刺激分子 CD40L、CTLA4蛋白表達(dá)以及PBMCs增值的影響,探討PYK2活化后的功能,從而探討PYK2活化在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 自從半個多世紀(jì)以前人們開始應(yīng)用皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡以來,激素治療己成為狼瘡腎炎治療的主流。然而,重癥狼瘡腎炎(主要是Ⅳ型及部分Ⅲ型)

8、的高死亡率并未因此得到解決。上個世紀(jì)80年代美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)開始倡導(dǎo)環(huán)磷酞胺(cyclophosphamide,CTX)大劑量靜脈注射療法,從此糖皮質(zhì)激素結(jié)合免疫抑制劑的藥物治療方案成為SLE治療的首選。糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑對免疫反應(yīng)的許多環(huán)節(jié)都有抑制作用,對合并有腎臟等重要臟器損害患者有重要價值,是現(xiàn)有治療SLE最重要的藥物。然而,在糖皮質(zhì)激素結(jié)合免疫抑制劑的治療過程中,由于用藥量大、時間長,容易出現(xiàn)副作用和并發(fā)癥,60

9、％以上患者最后死于它們的毒副作用,嚴(yán)重影響患者的生存期和生活質(zhì)量。近年來發(fā)展起來的血液凈化、生物制劑和造血干細(xì)胞移植等治療方法雖然能在不同程度上緩解病情,但均不能達(dá)到根治的目的。SLE的治療仍然是當(dāng)今的難點(diǎn)問題,人們一直在探索一種療效確切又無副作用的藥物以改善患者的長期預(yù)后和生存質(zhì)量。
　　 姜黃素(Curcumin)是古老亞洲的一種藥用植物姜黃的有效成分,自從1937年Lancet刊登了一篇姜黃素治療人類疾病的文獻(xiàn)后,至今已有

10、2700多篇關(guān)于研究姜黃素的文獻(xiàn)發(fā)表。姜黃素可以在基因、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、阻滯細(xì)胞周期、免疫調(diào)節(jié)等多途徑上發(fā)揮抗腫瘤、抗炎、抗調(diào)亡、抗氧化作用。從目前動物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用的效果看,姜黃素是一種療效好、無毒、無副作用的新型抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)藥物,姜黃素與免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用均有良好的協(xié)同作用。目前姜黃素已在治療腫瘤、粥樣硬化、感染]、多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)揮了重要作用。但對于姜黃素治療SLE的研究目前尚無報(bào)道。鑒于姜黃素在自身免疫性疾病治療中具

11、有良好的應(yīng)用前景,并且本研究第一部分已經(jīng)探討了PYK2信號蛋白的活化可能在SLE發(fā)病機(jī)理和治療中具有重要意義,因此闡明姜黃素的抗自身免疫作用是否與PYK2途徑相關(guān)顯得尤為重要。本研究將測定姜黃素對SLE患者PBMCs PYK2表達(dá)和活性的影響,探討姜黃素對SLE的治療作用是否與姜黃素對PYK2的活化的影響有關(guān)。
　　 研究對象與方法
　　 第一部分研究PYK2信號蛋白在SLE患者PBMCs的表達(dá)和活化及活化后的功能。選用

12、48例SLE患者、32例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者(RA)和24例健康自愿者作為研究對象。晨起空腹抽取靜脈血20ml,分離PBMCs,一部分直接用于PYK2表達(dá)和活化的測定,另一部分PBMCs用 RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成1 X109/ml,取細(xì)胞懸液置6孔板中,每孔各1ml,設(shè)3個組:①單純培養(yǎng)組；②PMA刺激組；③PMA刺激組+TyrA9阻斷組。Western Blotting測定各組患者PBMCs PYK2總蛋白和其活化蛋白(p-PYK2

13、)的表達(dá),細(xì)胞免疫組化測定p-PYK2表達(dá)的細(xì)胞類型,流式細(xì)胞術(shù)測定PYK2活化對PBMCs表達(dá)共刺激分子CD40L和 CTLA4的影響,3H-thymidine滲入法測定PYK2活化對PBMCs增值的影響。第二部分研究姜黃素對SLE患者PBMCsPYK2表達(dá)和活化的影響。選用20例活動期SLE患者和20例健康志愿者作為研究對象。晨起空腹抽取靜脈血20ml,分離PBMCs,用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成1 X106/ml,取細(xì)胞懸液置6

14、孔板中,每孔各1ml,設(shè)4個組:①單純培養(yǎng)組；②PMA刺激組；③PMA刺激組+TyrA9阻斷組；④PMA刺激組+姜黃素組。培養(yǎng)結(jié)束收集各孔細(xì)胞,Western Blotting測定各組患者PBMC PYK2總蛋白和其活化蛋白(p-PYK2)的表達(dá)；細(xì)胞免疫組化測定p-PYK2表達(dá)的細(xì)胞類型；SYBR Green I real-time定量PCR研究姜黃素對PBMCs表達(dá)共刺激分子CD40L和CTLA4 mRNA的影響；流式細(xì)胞術(shù)測定姜黃

15、素對PBMCs表達(dá)共刺激分子CD40L和CTLA4蛋白表達(dá)的影響,3H-thymidine滲入法測定姜黃素對PBMCs增值的影響。
　　 結(jié)果
　　 1、與健康自愿者比較,非活動期SLE-患者和活動期SLE患者的PBMCPYK2表達(dá)和活化均明顯增高,而RA患者的PBMCs PYK2表達(dá)和活化均未見明顯升高。
　　 2、WHOⅣ型狼瘡腎炎的患者PBMCs p-PYK2的表達(dá)明顯高于健康自愿者、其他類型狼瘡腎炎和伴有

16、中樞神經(jīng)合并癥者。p-PYK2的活化和SLE患者血清總補(bǔ)體水平呈明顯負(fù)相關(guān)(P＜0.01,r=-0.668),與抗核小體抗體呈正相關(guān)(P＜0.05,r=0.535),與其他抗體的滴度均無相關(guān)性。p-PYK2的表達(dá)水平和SLEDAI積分亦無相關(guān)性。
　　 3、PMA刺激后,SLE組、RA組和健康對照組PBMCs PYK2活化均明顯增高。
　　 4、應(yīng)用PMA促進(jìn)PYK2的活化后,SLE患者、RA患者和健康志愿者PBMCs