MTDH介導(dǎo)AKT信號(hào)通路調(diào)控頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一章MTDH在頭頸鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的：異粘蛋白(Metadherin，MTDH)是新近發(fā)現(xiàn)的癌基因，在大多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而，其在頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用并不十分清楚。因此，本研究檢測(cè)MTDH在頭頸鱗癌中的表達(dá)及臨床意義，并初步探討其在頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)189例頭頸鱗癌石蠟組織標(biāo)本及27例癌旁粘膜組織中MTDH、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Ep

2、ithelial to Mesenchymal Transition，EMT)標(biāo)志蛋白E-cadherin及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)的表達(dá)及分布特征，并分析MTDH表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，以及MTDH表達(dá)與E-cadherin、VEGF表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：1）MTDH蛋白在頭頸鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與頭頸鱗癌腫瘤原發(fā)部位(P=0.033)、T分

3、期(P=0.001)、臨床分期(P=0.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000)、腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)(P=0.000)密切相關(guān)。2）Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示MTDH蛋白高表達(dá)組患者術(shù)后復(fù)發(fā)和死亡率較低表達(dá)組明顯增高，5年累積總生存率分別為37.6％與72.6％，5年累積無瘤生存率分別為31.8％和68.6％，log-rank檢驗(yàn)證實(shí)兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=20.135，P＜0.001;x2=22.058,P＜0.001)。多

4、因素回歸分析表明，MTDH表達(dá)水平是頭頸鱗癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。3）Spearman秩相關(guān)檢測(cè)結(jié)果顯示MTDH表達(dá)與E-cadherin表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.336，P＜0.001)，與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.319，P＜0.001)。
　　結(jié)論：1）MTDH蛋白在頭頸鱗癌中高表達(dá)，其高表達(dá)與頭頸鱗癌患者的腫瘤發(fā)生部位、T分期、臨床分期、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并顯著影響患者的預(yù)后。2）MTDH表達(dá)與E-cadherin表

5、達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，提示MTDH可能調(diào)控頭頸鱗癌EMT和血管新生。
　　第二章 MTDH通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控頭頸鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移
　　目的：前述研究證實(shí)MTDH與頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移和EMT分子標(biāo)志物E-cadherin密切相關(guān)，因此，我們進(jìn)一步檢測(cè)MTDH對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞體外遷移侵襲和EMT的調(diào)控。
　　方法：利用慢病毒載體介導(dǎo)的MTDH表達(dá)及沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染頭頸鱗癌細(xì)胞Tu686，建立穩(wěn)定高表達(dá)和沉默MTD

6、H的頭頸鱗癌細(xì)胞株，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變;Western blot檢測(cè)EMT分子標(biāo)志物E-cadherin、vimentin表達(dá)水平改變;劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)頭頸鱗癌細(xì)胞體外遷移及侵襲潛能變化情況。
　　結(jié)果：建立了穩(wěn)定高表達(dá)和沉默MTDH的頭頸鱗癌細(xì)胞株及空載體對(duì)照細(xì)胞株，并分別命名為TU686MTDHpcDNA(+)（MTDH過表達(dá)細(xì)胞）、TU686MTDHpcDNA(-)（轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞）

7、、Tu686MTDHRNAi(+)(MTDH沉默細(xì)胞)、TU686MTDHRNAi(-)（轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞）。Tu686細(xì)胞MTDH蛋白過表達(dá)后，細(xì)胞間連接松散，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，有偽足形成，且E-cadherin表達(dá)下降，vimentin表達(dá)升高，細(xì)胞遷移、侵襲能力增強(qiáng)。48 h后Tu686細(xì)胞、TU686MTDHpcDNA(-)細(xì)胞、Tu686MTDHpcDNA(+)細(xì)胞劃痕愈合率分別為15±14％，18±8％，84±15％(P＜0.

8、05)。48 h后穿過transwell侵襲小室的Tu686細(xì)胞、TU686MTDHpcDNA(-)細(xì)胞、Tu686MTDHpcDNA(+)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)分別為224±15，214±6，317±8(P＜0.05)。而TU686MTDHRNAi(+)細(xì)胞與TU686MTDHRNAi(-)細(xì)胞、Tu686細(xì)胞比較，E-cadherin表達(dá)升高，vimentin表達(dá)檢測(cè)不到，細(xì)胞遷移、侵襲潛能明顯降低。48 h后Tu686細(xì)胞、TU686MTDH

9、RNAi(-)細(xì)胞、Tu686MTDHRNAi(+)細(xì)胞的劃痕愈合率分別為29±5％，28±6％，9±4％(P＜0.05)。48 h后穿過transwell侵襲小室的Tu686細(xì)胞、TU686MTDHRNAi(-)細(xì)胞、TU686MTDHRNAi(+)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)分別為250±20，241±24，139±12(P＜0.05)。
　　結(jié)論：MTDH可通過EMT調(diào)控頭頸鱗癌細(xì)胞體外遷移侵襲。
　　第三章 MTDH調(diào)控頭頸鱗癌細(xì)胞V

10、EGF表達(dá)
　　目的：血管生成因子調(diào)控血管新生在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。前期研究表明MTDH表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)。進(jìn)而，本研究在體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MTDH對(duì)頭頸鱗癌中VEGF表達(dá)的調(diào)控。
　　方法：利用慢病毒載體建立穩(wěn)定高表達(dá)和沉默MTDH的頭頸鱗癌細(xì)胞株基礎(chǔ)上，western blot檢測(cè)VEGF細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平改變;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)VEGF細(xì)胞外分泌情況。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果

11、表明MTDH過表達(dá)后Tu686細(xì)胞VEGF的胞內(nèi)表達(dá)增高，相反，MTDH表達(dá)沉默后，Tu686細(xì)胞VEGF的胞內(nèi)表達(dá)降低。Elisa結(jié)果顯示Tu686MTDHpcDNA(+)細(xì)胞、Tu686MTDHpcDNA(-)細(xì)胞、Tu686細(xì)胞上清中VEGF含量(pg/ml)分別為498.65±32.19，324.14±33.66，334.93±42.26，Tu686MTDHpcDNA(+)細(xì)胞組與TU686MTDHpcDNA(-)細(xì)胞組、Tu6

12、86細(xì)胞組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，MTDH促進(jìn)Tu686細(xì)胞VEGF胞外分泌。MTDH表達(dá)被抑制后VEGF胞外分泌降低，TU686MTDHRNAi(+)細(xì)胞、TU686MTDHRNAi(-)細(xì)胞、Tu686細(xì)胞上清中VEGF含量(pg/ml)分別為267.71±41.39，427.19±60.47，412.48±35.72，TU686MTDHRNAi(+)細(xì)胞組與TU686MTDHRNAi(-)細(xì)胞組、Tu686細(xì)胞組比

13、較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：MTDH可調(diào)控頭頸鱗癌細(xì)胞VEGF的胞內(nèi)表達(dá)和胞外分泌，提示MTDH可能調(diào)控頭頸鱗癌血管新生。
　　第四章 MTDH通過AKT信號(hào)通路調(diào)控頭頸鱗癌EMT及VEGF表達(dá)
　　目的：探討MTDH調(diào)控頭頸鱗癌EMT及VEGF表達(dá)的分子機(jī)制。
　　方法：利用慢病毒載體建立穩(wěn)定高表達(dá)和沉默MTDH的頭頸鱗癌細(xì)胞株基礎(chǔ)上，western blot檢測(cè)AKT、p-AKT表達(dá)水平

14、;小RNA干擾技術(shù)沉默TU686MTDHpcDNA(+)細(xì)胞的AKT表達(dá)，western blot、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)EMT分子標(biāo)志物(E-cadherin、vimentin)表達(dá)水平改變、遷移及侵襲潛能變化情況;Western blot、ELISA實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)VEGF細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和細(xì)胞外分泌情況。
　　結(jié)果：MTDH過表達(dá)后AKT、p-AKT表達(dá)增加，相反，沉默MTDH表達(dá)后AKT、p-AKT表達(dá)

15、降低。siRNA抑制Tu686MTDHpcDNA(+)細(xì)胞的AKT表達(dá)后，p-AKT表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)升高，vimentin表達(dá)降低，細(xì)胞遷移、侵襲能力也降低（78±15％ vs11±5％;274±22 vs157±22;P＜0.05）;同時(shí)，western bloth和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到VEGF的胞內(nèi)表達(dá)及胞外分泌均降低。TU686MTDHpcDNA㈩細(xì)胞組、siRNA組胞外VEGF含量分別為535.27±47.72