煙草NtWRKY4和NtWRKY9的基因功能分析.pdf

1、本論文以傳統(tǒng)植物材料——煙草(NicotianatobacumL.)為實(shí)驗(yàn)材料，運(yùn)用分子遺傳學(xué)和生物技術(shù)等研究方法和手段，進(jìn)行了植物抗逆信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之中兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)控基因的分子生物學(xué)功能的研究。 實(shí)驗(yàn)以栽培煙草為研究材料，通過文獻(xiàn)分析，歸納出10個(gè)具有WRKY基因家族結(jié)構(gòu)域的基因，經(jīng)過引物設(shè)計(jì)，分別經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得200-500bp的基因片斷，并克隆到TA載體，經(jīng)序列分析后，再將這些片斷分別亞克隆到pHANNIBAL載體，構(gòu)建成

2、ds-RNA表達(dá)載體(RNAi方法)。隨后將構(gòu)建好的ds-RNA基因表達(dá)載體亞克隆到帶有35S強(qiáng)啟動子的pOCA30載體，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別將10個(gè)WRKY基因ds-RNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草葉片細(xì)胞，經(jīng)抗性愈傷組織篩選和植株再生，并經(jīng)NorthernBlot分子檢測，獲得轉(zhuǎn)基因株系。然后，比較系統(tǒng)地對轉(zhuǎn)基因植物T1代植株形態(tài)變化進(jìn)行了觀察分析，用假單孢菌Pseudomonassyringaepv.tomatostrainDC3

3、000菌株、煙草花葉病毒TMV和爪哇根結(jié)線蟲(MeloidogynejavanicaChitwood)侵染以及非生物逆境因子處理，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗病性和抗逆性。 本研究發(fā)現(xiàn)了二個(gè)煙草WRKY基因的重要生物學(xué)功能。 其中基因WRKY9對線蟲處理有積極響應(yīng)。采用不同的線蟲濃度、不同的植株數(shù)量、不同的溫度進(jìn)行處理，結(jié)果都是：高抑制NtWRKY9基因的轉(zhuǎn)基因植株與對照相比，降低了對線蟲的抗病性。線蟲侵染的抗性鑒定項(xiàng)目是：根結(jié)百

4、分率、腐爛根百分率、地上部分重和根重。結(jié)果表現(xiàn)為：根結(jié)出現(xiàn)早，根增粗快，根結(jié)多，帶根結(jié)的根比例高，根較早衰老，生物量降低等。 分子檢測結(jié)果證明該基因主要在根中表達(dá)。NtWRKY9轉(zhuǎn)基因植株受到線蟲感染以后，無論在葉中或在根中，PR1基因增強(qiáng)了表達(dá)量。PR2基因則受影響較小，增強(qiáng)幅度小。煙草抗線蟲相關(guān)基因Extensin，在線蟲感染前和感染后，轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比，表達(dá)量沒有顯著變化。 煙草WRKY4基因?qū)A和TMV處

5、理響應(yīng)積極。實(shí)驗(yàn)中NtWRKY4基因能夠被SA誘導(dǎo)，而且被其它非生物逆境因子誘導(dǎo)的表達(dá)量低。通過TMV病毒接種，轉(zhuǎn)基因植株對病毒有清楚的響應(yīng)，形態(tài)發(fā)生了顯著的變化，花葉更重，葉片變形、扭曲，證明NtWRKY4確實(shí)與抗病性有關(guān)。感染病原細(xì)菌P.S.DC3000細(xì)菌也同樣證明了其與抗病性有關(guān)。 TMV病毒在野生型植株中的積累相對迅速地增強(qiáng)，并較迅速地減弱，對葉片形態(tài)影響較小，而轉(zhuǎn)基因植株則因?yàn)镹tWRKY4受到抑制而積累時(shí)間長，抗性

6、降低，形態(tài)受到嚴(yán)重影響，造成畸形葉，證明NtWRKY4與調(diào)控抗病毒過程有關(guān)。但TMV并不能誘導(dǎo)NtWRKY4的表達(dá)，說明在整個(gè)抗病信號傳導(dǎo)過程中，NtWRKY4不受TMV的調(diào)控。 轉(zhuǎn)基因植株中PR基因在TMV誘導(dǎo)時(shí)受到抑制，證明NtWRKY4與PR基因表達(dá)有正相關(guān)關(guān)糸。 抑制NtWRKY4基因，造成煙草的抗干旱性受到影響，說明NtWRKY4還參與非生物逆境的調(diào)控過程，是煙草中重要的抗逆性相關(guān)基因。 本研究首次證實(shí)