泥鰍腸道益生菌的篩選及應用研究.pdf

1、本文對泥鰍幼魚和成魚腸道菌群多樣性進行分析，并從中篩選出在體外能產多種酶以及對常見致病菌有較強拮抗作用的潛在益生菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），并且評估投喂對泥鰍幼魚生長、消化酶和非特異性免疫的影響，以期為益生菌在泥鰍配合飼料中的應用提供參考。
　　本研究主要內容包括：⑴運用高通量測序方法研究健康泥鰍成魚和幼魚腸道菌群組成。試驗分為3組，馴化幼魚組（C1）、野生幼魚組（N1）和野生成魚組（N2）。提取腸道基因

2、組DNA，PCR擴增16SrRNA基因V3-V4片段，采用Illumina公司的Miseq測序平臺進行測序。在門水平上，在泥鰍馴養(yǎng)幼魚(C1）和野生幼魚（N1)中變形菌門占絕對優(yōu)勢，分別為整個菌群的91.3％、94.4%，厚壁菌門為次優(yōu)勢菌群，分別占8.5%、4.0%；在野生泥鰍成魚（N2）中，變形菌門占絕對優(yōu)勢占79.6%，梭桿菌門為次優(yōu)勢菌群占18.4%。在屬水平上，馴養(yǎng)組幼魚（C1）腸道菌群有14個屬，其中氣單胞菌屬和不動桿菌屬占

3、整個腸道菌群的84.4%；野生幼魚（N1）腸道菌群有17個屬依次其中不動桿菌屬和氣單胞菌屬占整個腸道菌群的90.2%。野生成魚（N2）腸道菌群有24個屬，其中氣單胞菌屬、不動桿菌屬和鯨桿菌屬占整個腸道菌群的89.3%。⑵將從野生泥鰍幼魚和成魚腸道分離的93株細菌進行體外產酶試驗和對常見水生動物病原菌（嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、副溶血弧菌和腐敗希瓦氏菌）的拮抗試驗，得到6株能產3種酶（淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶）的菌株和2株有拮抗活性的菌株

4、，再通過溶血性試驗篩選出3株無溶血活性的菌株分別為N1-08、N2-08和N2-26菌株。選擇同時具有拮抗活性和產酶活性的N1-08菌株，進行安全性試驗，將菌懸液（109 cells/mL）通過腹腔注射泥鰍幼魚，每尾200μL。結果表明，該菌株對泥鰍幼魚均無致病性。16S rRNA序列分析表明，N1-08菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，AB735994）相似。⑶以基礎餌料為對照組（C），在養(yǎng)殖實驗室中進行為期4周