高產蛋白酶益生菌的篩選、鑒定及應用研究.pdf

1、山東農業(yè)大學碩士學位論文高產蛋白酶益生菌的篩選、鑒定及應用研究姓名：張春楊申請學位級別：碩士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：牛鐘相常維山2001.6.1高產蛋白酶益生菌的篩選、鑒定及應用研究摘要菌種是益生素產品質量和應用效果的關鍵因素之～。長期以來，各國都在尋求自己的菌源。本研究從山東泰安不同飼養(yǎng)場采集鏈康動物的糞便或腸內容物以及肥沃的土壤進行了產蛋白酶芽胞桿菌的分離，在產酶特性研究和動物安全試驗的基礎上，篩選出產酶較高的H1株，并進行了鑒定

2、。然后利用H1菌株在特定條件下制各成益生素(高產蛋自酶的益生素)，并進行了動物飼喂實驗，結果表明，該益生素具有良好的蝤床應且效果。體研究共分三部分：第一部分，菌種篩選。采集山東省泰安市不同飼養(yǎng)場的健康動物(牛、豬、雞)的糞便或腸內容物共32頭份以及山東農業(yè)大學實驗菜田中肥沃的土壤3份，稀釋】0?！?2后，】00℃處理5rain以殺滅非芽胞菌，然后用酪素水解培養(yǎng)基共分離出產蛋白酶的芽胞桿菌44株。對于酪素水解圈較大(2cm)的13株菌，

3、用Folin法測定其產生的蛋白酶活力，進一步篩選到產蛋白酶活力較高的Hl菌株，在48h發(fā)酵液中可產生103256U／ml的蛋白酶。通過對產酶特性的研究發(fā)現(xiàn)其在發(fā)酵培養(yǎng)基中48h產酶最多，活力可達109905U／ml；而培養(yǎng)基的pH值對細菌產酶有直接的影響，在PH65～80之間，產酶隨pH值的增高而減少在pH65時，產酶較高，可達125940U／ml。在pH72的培養(yǎng)基中，活菌數量在0～48h內，隨時間延長而增多，36h時細菌開始形成芽胞

4、體，到48h達穩(wěn)定期活菌數量在此時達最高值(12109CFU／m1)：而pH值的變化趨勢是，在12h內迅速降至652，然后緩慢升高至814。H1菌株所產蛋白酶為高溫中性蛋白酶，在pH75和50“C下活力最高，最高值為165444U／ml，在體況(pH75，40“C)下也能達158404U／ml的活力。Bulb／C小鼠腹腔注射和海蘭白公雛口服試驗均表明，該菌對動物安全。第二部分，菌種鑒定。對篩選出的Hl菌株進行培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)、生理生化

5、等方面的鑒定，并進行了石蕊牛乳試驗、吸氧力試驗和藥物敏感試驗。根據tiff杰氏細菌鑒定手冊》并結合H1菌株和標準菌株的特性，鑒定H1菌株為枯草芽胞桿菌。石蕊牛乳試驗表明，在石蕊牛乳培養(yǎng)基中，該菌優(yōu)先利用乳糖產酸，其次分泌蛋白酶水解酪蛋白產生堿性物質。吸氧力試驗表明，該菌具有較強的吸氧力，可以促進厭氧菌的生長。藥敏試驗結果表明，該菌除對青霉素產生耐藥性外，對其他多種抗菌藥均敏感。第三部分，菌種應用。將Hl菌株利用改良培養(yǎng)基進行發(fā)酵，然后制