Ⅰ型γ分泌酶抑制劑在惡性膠質瘤放射增敏中的作用與機制研究.pdf

1、前言 惡性膠質瘤是最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤,其浸潤性生長的特點及對放、化療的不敏感導致臨床治療相當棘手。手術切除配合術后放療是目前最常用的治療手段,但療效差強人意,約70％的惡性膠質瘤在術后1年復發(fā)[1-4]。究其因為,腫瘤難以徹底切除,殘留瘤細胞對后續(xù)放療的敏感性差是導致惡性膠質瘤復發(fā)率高的主要因素。因此,如何提高惡性膠質瘤的放療敏感性成為攻克這一腫瘤的主要努力方向。
　　 腫瘤細胞放射抗性的產(chǎn)生多與下列因素有關:①腫瘤細胞超

2、強的DNA損傷修復能力。部分腫瘤細胞高表達DNA損傷修復相關蛋白,能迅速修復受損DNA,因此對放射治療產(chǎn)生抗性[5]。②腫瘤細胞較強的抗凋亡能力[15]。惡性腫瘤細胞中某些促存活、抗凋亡通路及分子,如表皮生長因子受體通路,PI3K-Akt通路,p53,Survivin等往往高表達,致使腫瘤細胞抵抗射線誘導的凋亡。最近有文獻報道,Notch通路是促進惡性膠質瘤細胞放療抗性的一條重要信號通路,而其機制正是通過上調(diào)膠質瘤細胞內(nèi)Akt等抗凋亡通

3、路的表達[8]。因此削弱腫瘤細胞的DNA損傷修復能力,促進其凋亡是惡性腫瘤放射增敏的主要策略之一。③腫瘤干細胞的放療抗性。近年來研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細胞在惡性腫瘤的放射抵抗中發(fā)揮不可忽視的作用[13],其機制正與腫瘤干細胞超強的DNA損傷修復能力及抗凋亡能力有關。存活下來的腫瘤干細胞成為腫瘤復發(fā)的根源。這一點,我們在實驗中也有類似發(fā)現(xiàn)。
　　 目前對腫瘤細胞放射增敏的研究已進展到分子治療手段,例如針對放射敏感基因的小分子干擾RNA(

4、siRNA)、單克隆抗體[14]等。但這些方法都存在一些問題--基因轉移效率低成為制約基因治療應用的瓶頸；針對單一基因的治療在體內(nèi)實驗中很難得到令人滿意的結果,等等[15]。這些都促使我們尋找一種新的更安全有效,且易于操作的放療增敏方法,而我們的研究工作發(fā)現(xiàn),γ分泌酶抑制劑(gamma secretase inhibitor,GSI)有望成為一類理想的放射增敏劑。
　　 GSI能抑制細胞內(nèi)γ分泌酶的活性。過去,人們對GSI的研究

5、多集中在阿爾茨海默病的治療上[16]。近年來人們發(fā)現(xiàn),GSI還具有很強的抗腫瘤效應[17],而這主要是通過抑制Notch信號通路實現(xiàn)的。Notch信號通路已被證實與多種腫瘤的發(fā)生進展密切相關,如急性淋巴細胞性白血病[21,21]、卵巢癌[22]、乳腺癌[23]、髓母細胞瘤及惡性膠質瘤等[24,25]。目前已被體外/體內(nèi)實驗證實具有抗腫瘤活性的GSI有多種[26-30],但有關GSI抗惡性膠質瘤的研究還很少,特別是GSI在惡性腫瘤放射增敏

6、中的作用未見報道。因此,我們著手進行該方面研究。
　　 目的以人惡性膠質瘤細胞株U87、U251細胞為主要實驗對象,通過體內(nèi)/體外實驗,研究Ⅰ型γ分泌酶抑制劑(GSI-Ⅰ)對膠質瘤細胞的細胞毒作用及放射增敏作用,并以CD133+膠質瘤干細胞為切入點,探討GSI-Ⅰ放射增敏的作用機制,為GSI的抗腫瘤效應提供新證據(jù),為惡性膠質瘤的臨床治療,特別是輔助放療提供新思路。
　　 方法 第一部分實驗中,我們采用MTT法檢測梯度濃度

7、的GSI-Ⅰ對U87、U251細胞生長曲線的抑制作用,利用流式細胞術分析GSI-Ⅰ對U87、U251細胞細胞周期及凋亡的作用,利用免疫印跡法及熒光實時定量RT-PCR等技術研究GSI-Ⅰ對U87、U251細胞中Notch信號通路及其下游一些細胞周期、凋亡相關蛋白表達的影響,初步探討GSI-Ⅰ細胞毒作用的分子機制。
　　 第二部分實驗中,我們采用克隆形成實驗分析低濃度GSI-Ⅰ對U87、U251細胞放射敏感性的影響；利用磁式細胞分

8、選技術(Magnetic Activated CellSorting,MACS)分離U87、U251細胞中的CD133+/CD133￣細胞,CD133+細胞培養(yǎng)于無血清的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中,CD133￣細胞培養(yǎng)于含血清的MEM培養(yǎng)基中。分別研究低濃度GSI-Ⅰ對CD133+/CD133￣膠質瘤細胞的放射增敏作用。利用熒光標記的CD133抗體和流式細胞術,分析GSI-Ⅰ對U87、U251細胞及1例原代培養(yǎng)惡性膠質瘤細胞中CD133+細胞比

9、例的影響。采用體外成球實驗及臺盼藍染色實驗分析GSI-Ⅰ對CD133+/CD133￣膠質瘤細胞的毒性作用。最后,利用裸鼠成瘤實驗在體內(nèi)檢測GSI-Ⅰ對膠質瘤細胞的成瘤抑制作用及放射增敏作用。
　　 結果 第一部分實驗主要研究GSI-Ⅰ對膠質瘤細胞株U87及U251的細胞毒作用。MTT結果顯示,GSI-Ⅰ對U87及U251細胞的生長曲線有抑制作用,且隨著濃度與時間的增加而加大。進一步研究表明,GSI-Ⅰ對膠質瘤細胞的毒性作用主要為

10、細胞周期阻滯及誘導凋亡:2.5μmol/L GSI-Ⅰ作用48h后,U87細胞的G1期細胞比例從43.8±1.99％增加至52.96±1.36％(P=0.003),而S期細胞比例從24.81±1.5％減少為9.34±0.53％(P=0.000),G2期細胞比例略有增加；U251細胞則觀察到在G1期、S期細胞比例下降的同時,G2期細胞比例大幅增加(從10.43±1.39％到46.97±2.24％,P=0.000)；在誘導凋亡方面,1μmo

11、l/LGSI-Ⅰ作用24h或48h,U87細胞的凋亡率較低,分別為2.8±0.48％和2.99±0.55％；U251細胞的凋亡率稍高,分別為3.85±0.52％和9.22±0.25％；2.5μmol/LGSI-Ⅰ作用48h后,U87細胞的凋亡率達到10.29±0.94％,U251細胞的凋亡率則高達22.99±0.94％。
　　 為探索GSI-Ⅰ細胞毒作用的可能機制,我們采用RT-PCR、qRT-PCR及Western Blot技

12、術檢測GSI-Ⅰ對細胞內(nèi)Notch信號通路的阻斷作用及對一些細胞周期、凋亡相關蛋白的影響。結果顯示,Notch-2、Notch-3在U87、U251細胞中表達；GSI-Ⅰ作用12-24小時即可降低Notch靶基因Hes-1的表達,證明GSI-Ⅰ對Notch通路有阻斷作用。GSI-Ⅰ作用后兩種細胞的抗凋亡蛋白Akt及S6K的磷酸化程度略有降低。U87細胞的Cyclin D1表達下調(diào),U251細胞的CyclinB1表達下調(diào),兩種細胞的CDK

13、2都有明顯下調(diào)。說明GSI-Ⅰ對膠質瘤細胞株的抗凋亡及細胞周期蛋白的活性及表達有影響。這可能是GSI-Ⅰ抗膠質瘤效應的分子機制之一。
　　 第二部分實驗主要探討 GSI-Ⅰ的放射增敏作用及體內(nèi)抗腫瘤作用?？寺⌒纬蓪嶒烇@示,低濃度GSI-Ⅰ對U87、U251細胞有顯著的放射增敏作用。為探討放射增敏機制,我們用Western Blot技術檢測與DNA修復有關的細胞周期檢測點蛋白CHK1、CHK2的表達,發(fā)現(xiàn)無影響；檢測抗凋亡蛋白Ak

14、t的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)放射后Akt磷酸化水平增加,在GSI-Ⅰ的作用下則明顯降低,提示抑制Akt的活性可能參與GSI-Ⅰ的放射增敏作用。
　　 我們還發(fā)現(xiàn),CD133+膠質瘤干細胞的放射抗性要高于CD133￣膠質瘤細胞,而GSI-Ⅰ則顯著降低CD133+膠質瘤干細胞的放射抗性。流式細胞分析顯示,放射后膠質瘤細胞中的CD133+細胞比例大幅增加,而1μmmol/L GSI-Ⅰ作用24小時可顯著減少CD133+細胞比例,提示GSI-Ⅰ

15、通過消除CD133+膠質瘤細胞達到放射增敏的效應。體外成球實驗顯示,GSI-Ⅰ可明顯抑制CD133+膠質瘤干細胞的體外成球能力。臺盼藍染色實驗顯示,1 μmmol/L GSI-Ⅰ對CD133+膠質瘤細胞的毒性大于CD133￣膠質瘤細胞,而隨著GSI-Ⅰ濃度的增加,它對CD133+/CD133￣膠質瘤細胞的毒性作用無差異。說明低濃度GSI-Ⅰ可靶向抑制CD133+膠質瘤干細胞。qRT-PCR結果顯示,CD133+U87細胞中Notch-2

16、、Notch-3受體及靶基因Hes-1的表達水平明顯高于CD133￣細胞,提示GSI-Ⅰ的靶向抑制CD133+膠質瘤細胞可能與此有關。
　　 裸鼠實驗表明,經(jīng)1 μmmol GSI-Ⅰ處理的U87細胞,其體內(nèi)成瘤能力下降,瘤體積比對照組小。對正常U87細胞成瘤的瘤組織,瘤周注射GSI-Ⅰ,可導致瘤組織大片壞死。免疫組化染色結果顯示,GSI-Ⅰ能顯著降低移植瘤細胞中Hes-1和Nestin的表達,說明Notch信號通路被阻斷且腫瘤