惡性膠質(zhì)瘤在器官型腦片模型中的侵襲及抗侵襲研究.pdf

1、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是顱內(nèi)常見惡性腫瘤，目前臨床上采用手術(shù)、放療、化療、生物治療等綜合治療，但仍存在高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高病死率等問題，因此，在對人惡性腦膠質(zhì)瘤的治療研究中，尋找一種更加有效的治療方法成為一項刻不容緩的課題。近年發(fā)現(xiàn)了hMena，MMPs，Rho GTPases等一系列與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲遷移有關(guān)的蛋白，從而認(rèn)識到與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性相關(guān)的骨架構(gòu)筑分子蛋白、運(yùn)動調(diào)控蛋白的異常表達(dá)及活性，是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向鄰近腦實質(zhì)侵襲、向遠(yuǎn)隔遷

2、移的主要原因之一。因此，抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲遷移，可以立足于控制膠質(zhì)瘤細(xì)胞本身的運(yùn)動相關(guān)蛋白。
　　 理解惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞在腦實質(zhì)內(nèi)播散及運(yùn)動相關(guān)蛋白在細(xì)胞運(yùn)動中的作用是治療惡性膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵。綠色熒光蛋白作為一種報告蛋白為我們提供了觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞運(yùn)動的標(biāo)記。三維膠質(zhì)瘤細(xì)胞-腦片共培養(yǎng)模型為我們提供了膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)運(yùn)動的環(huán)境。通過培養(yǎng)于腦片的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，可以追蹤觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞在腦片內(nèi)的運(yùn)動方式。
　　 Rac1是重要肌動

3、蛋白骨架調(diào)控蛋白，控制板狀偽足的形成。Rac1激活其下游效應(yīng)因子，并和這些效應(yīng)因子共同轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞運(yùn)動前端的細(xì)胞膜下，誘導(dǎo)肌動蛋白骨架重組，產(chǎn)生片狀偽足，從而促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動。有關(guān)膠質(zhì)瘤侵襲遷移的體外研究的傳統(tǒng)方法已證實，Rac1蛋白的活性與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)。我們通過膠質(zhì)瘤細(xì)胞-腦片共培養(yǎng)模型來驗證Rac1蛋白的活性與膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的關(guān)系。
　　 課題分為二部分進(jìn)行:
　　 1.建立膠質(zhì)瘤細(xì)胞-腦片共培養(yǎng)模型。為模

4、擬膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中的運(yùn)動，我們建立了膠質(zhì)瘤細(xì)胞-腦片共培養(yǎng)模型。首先，利用攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒感染大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，人U251、U87、LN229、SNB19五種細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀篩選并計數(shù)五種熒光細(xì)胞。為使細(xì)胞更好的接種于大鼠腦片表面，將篩選后的熒光細(xì)胞分別培養(yǎng)成綠色熒光細(xì)胞球。第二，利用振動切片機(jī)切取3周齡SD大鼠全腦，制作400μm厚腦片并培養(yǎng)于Millicell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿上。連續(xù)觀察腦片的形態(tài)及結(jié)構(gòu)7天，

5、碘化丙啶(PI)染色鑒定腦片神經(jīng)元活性。最后，將綠色熒光細(xì)胞C6細(xì)胞球接種于腦片表面，形成膠質(zhì)瘤細(xì)胞-腦片共培養(yǎng)模型。熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡觀察C6細(xì)胞在腦片上的侵襲和遷移。結(jié)果:利用倒置熒光顯微鏡觀察，5種膠質(zhì)瘤細(xì)胞成功轉(zhuǎn)入綠色熒光蛋白;利用流式細(xì)胞儀篩選出熒光細(xì)胞，熒光細(xì)胞比例為100％;利用慢速搖床法培養(yǎng)熒光細(xì)胞球，將篩選后的熒光細(xì)胞分別培養(yǎng)成大小約300～500μm的細(xì)胞球;SD大鼠完整全腦腦片可在體外培養(yǎng)成活;利用倒置顯微鏡

6、觀察，大鼠腦片連續(xù)培養(yǎng)7d后仍然保持完整的皮質(zhì)、尾狀核、胼胝體等組織結(jié)構(gòu)，PI染色證實腦片中神經(jīng)元仍保持活性;利用共聚焦激光掃描顯微鏡逐層掃描可見C6細(xì)胞在腦片中的侵襲及三維分布，侵襲過程中C6細(xì)胞形態(tài)保持良好。
　　 2.膠質(zhì)瘤細(xì)胞在器官型腦片模型中的侵襲及抗侵襲研究。為了評估膠質(zhì)瘤細(xì)胞在腦片上的遷移距離，通過倒置熒光顯微鏡我們測量了C6細(xì)胞不同時間在腦片上的遷移面積，利用同心圓的形式記錄了遷移直徑，計算出膠質(zhì)瘤的遷移速率。膠

7、質(zhì)瘤細(xì)胞-腦片共培養(yǎng)7天后，4％多聚甲醛固定，通過共聚焦顯微鏡逐層掃描分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞在腦片內(nèi)的侵襲深度。Rac1抑制劑NSC23766在腦片上對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞運(yùn)動的影響。實驗中分二組:NSC23766處理組:將C6熒光細(xì)胞球接種于腦片表面，于溫箱37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)3小時后，利用微量加液器將1μL濃度為100μg/ml的NSC23766滴入到C6熒光細(xì)胞球接種點，連續(xù)加入七天;對照組:將C6熒光細(xì)胞球接種于腦片表面，于

8、溫箱37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)3小時后，利用微量加液器將1μL PBS滴入到C6熒光細(xì)胞球接種點，連續(xù)加入七天。7天后，4％多聚甲醛固定，共聚焦顯微鏡掃描成像評價不同處理組C6細(xì)胞遷移和侵襲能力的差別。Rac1活性實驗和Western blotting分別檢測不同處理組C6細(xì)胞中GTP-Rac1、總Rac1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:熒光顯微鏡下觀察顯示C6細(xì)胞接種腦片表面后1、3、5、7天，遷移范圍隨時間的增加而逐漸增加，計算出

9、C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞7天在腦片表面的平均遷移速率為11.36-15.27μm/h;與對照組（侵襲深度198.0±9.2μm）比較，NSC23766處理組(侵襲深度105.3±10.3μm) C6細(xì)胞在腦片中的侵襲能力降低(P＜0.05);與對照組（光密度值0.308±0.003）比較，NSC23766處理組（光密度值0.139±0.016）C6細(xì)胞內(nèi)Rac1活性明顯降低（P＜0.05）;二組中總Rac1蛋白(光密度值0.862±0.023、0

10、.817±0.030)的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(P＞0.05);培養(yǎng)7天后，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生了沿著白質(zhì)纖維束遷移的極性。
　　 結(jié)論:
　　 1.綠色熒光蛋白作為一種報告蛋白標(biāo)記膠質(zhì)瘤細(xì)胞，可被用于追蹤膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。
　　 2.膠質(zhì)瘤細(xì)胞-腦片共培養(yǎng)模型是模擬膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)侵襲、遷移形式以及評估抗腫瘤治療的良好的實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　 3.在膠質(zhì)瘤細(xì)胞-腦片共培養(yǎng)模型中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生極性并沿白質(zhì)纖維