Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的增殖及凋亡的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一類惡性程度非常高的腦部腫瘤,由于該腫瘤的高侵襲性、耐藥性、抗放療性、早期轉(zhuǎn)移、原位復(fù)發(fā)等特性,大部分的患者的生存期都很短,只有1年左右。本研究首先利用RT-PCR法檢測(cè)Notch受體及其靶基因Hes-1在U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá).由于Hes-1是Notch通路調(diào)節(jié)的主要靶基因之一,通過(guò)檢測(cè)Hes-1基因的表達(dá)水平即可確定Notch通路的活化程度。因此,我們以熒光定量RT-PCR.法

2、定量分析GSI-Ⅰ對(duì)Notch通路的抑制作用；同時(shí),應(yīng)用MTT法分析GSI-Ⅰ和抗腫瘤藥物博來(lái)霉素(Bleocin,BLM)對(duì)上述兩種細(xì)胞的增殖抑制作用。下一步,我們利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了GSI-Ⅰ和BLM對(duì)U251、U87這兩種細(xì)胞株的細(xì)胞周期影響及誘導(dǎo)凋亡的作用。最后,采用蛋白印跡(western blot)技術(shù)進(jìn)一步分析了GSI-Ⅰ對(duì)U251、U87細(xì)胞的周期蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：
　　 1.U87和U251

3、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置37℃、5％的co2培養(yǎng)箱培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。
　　 2.notch信號(hào)通路受體及其下游基因Hes-1的檢測(cè)
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞,按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取總RNA,行RT-PCR檢測(cè)notch受體及其下游基因Hes-1的表達(dá)。
　　 3.GSI處理后Hes-1表達(dá)水平的檢測(cè)

4、
　　 U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)1 μ mol/L GSI和2.5 μ mol/L GSI分別處理4h,24,48h后,提取總RNA行熒光定量RT-PCR檢測(cè)Hes-1的表達(dá)水平。
　　 4.檢測(cè)GSI處理后對(duì)U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的的影響
　　 取生長(zhǎng)良好的U87和U251細(xì)胞細(xì)胞,用不同濃度的GSI處理,實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組,48h后,置酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)測(cè)各孔OD值,分析細(xì)胞的增殖能力。
　　

5、 5.檢測(cè)GSI+Bleocin對(duì)U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用的協(xié)同效應(yīng)
　　 實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、GSI各濃度組、Bleocin各濃度組及GSI+Bleocin各濃度組,處理48h后MTT法分析GSI、Bleocin和GSI+Bleocin對(duì)U87和U251細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　 6.GSI對(duì)U87和U251細(xì)胞周期的檢測(cè)
　　 U87和U251細(xì)胞經(jīng)GSI處理48h后,收集細(xì)胞并用70％的乙醇固

6、定至少6小時(shí),流式細(xì)胞儀分析GSI分別對(duì)U87和U251細(xì)胞周期各期的作用,同時(shí),利用蛋白印跡檢測(cè)GSI對(duì)U87和U251細(xì)胞周期蛋白的影響。
　　 7.檢測(cè)GSI、Bleocin、GSI+Bleocin對(duì)U87和U251細(xì)胞凋亡的影響
　　 不同濃度的GSI、Bleocin、GSI+Bleocin處理后,收集細(xì)胞,Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GSI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251的誘導(dǎo)調(diào)亡作用。
　

7、　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)、凋亡分析實(shí)驗(yàn)采用方差分析,GSI+Bleocin協(xié)同效應(yīng)實(shí)驗(yàn)采用析因設(shè)計(jì)的方差分析。
　　 本實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1.成功培養(yǎng)了人源性的U87、U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株,通過(guò)RT-PCR法,檢測(cè)到notch受體及notch信號(hào)

8、通路下游的靶基因Hes-1在U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中均有表達(dá),說(shuō)明notch信號(hào)通路在LJ87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是存在的。
　　 2.用GSI-Ⅰ處理U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞4～48小時(shí),經(jīng)熒光定量RT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,不同濃度的GSI分別處理4h,24h,48h后,Hes-1的表達(dá)顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)意義(F=14.965,P=0.000)。以上結(jié)果說(shuō)明經(jīng)GSI處理后,notch信號(hào)通路下游靶基因Hes-1

9、的表達(dá)與control組相比顯著性降低,并呈現(xiàn)出劑量依賴性,說(shuō)明GSI-ⅠI能有效抑制U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的notch信號(hào)通路的活性。
　　 3.檢測(cè)了不同濃度的GSI-Ⅰ對(duì)U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制作用,48h后行MTT法檢測(cè),結(jié)果顯示,2.5μmol/L及以上濃度的GSI能顯著抑制這兩種腫瘤細(xì)胞的增殖,差異具有顯著性(F=11.174,P=0.000)和(F=92.755,P=0.000)。說(shuō)明2.5μmol

10、/L及以濃度的GSI對(duì)U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞有顯著的增殖抑制作用,且該抑制作用呈劑量依賴型增加。而低濃度的GSI-Ⅰ(0.5μmol/L或1μmol/L)對(duì)細(xì)胞的抑制作用無(wú)顯著差異,說(shuō)明GSI-Ⅰ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有毒作用,但必須達(dá)到一定的濃度。
　　 4.本實(shí)驗(yàn)研究了BLM+GSI對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制是否具有協(xié)同效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明BLM+GSI比單用GSI處理對(duì)U87和U251細(xì)胞的增殖抑制作用更加顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=4.2

11、17,P=0.000)和(F=3.863,P=0.001)。說(shuō)明GSI+BLM聯(lián)用對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用具有協(xié)同效應(yīng),我們推測(cè),BLM抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的機(jī)理可能與其它腫瘤相似,也是通過(guò)作用于神經(jīng)膠質(zhì)痛細(xì)胞的增殖周期而抑制其增殖。
　　 5.為了進(jìn)一步闡明GSI-Ⅰ抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制,實(shí)驗(yàn)中首先我們通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了GSI-Ⅰ對(duì)U87及U251細(xì)胞周期的影響。加入DMSO或2.5μmol/L的GSI-ⅠⅠ作用48

12、h后,收集細(xì)胞并行細(xì)胞周期的檢測(cè),結(jié)果顯示,GSI-Ⅰ作用于U87膠質(zhì)瘤后,處于S期的細(xì)胞顯著減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,同時(shí)G1期細(xì)胞增多,說(shuō)明GSI-Ⅰ使U87細(xì)胞阻滯在G1期。在U251細(xì)胞中也檢測(cè)到S期細(xì)胞減少,但G1期細(xì)胞同樣減少,并且G2期細(xì)胞顯著增加,說(shuō)明GSI-Ⅰ對(duì)U251細(xì)胞的作用主要是G2期阻滯。G1期阻滯說(shuō)明細(xì)胞增殖受到抑制,而G2期阻滯則意味著凋亡即將發(fā)生。
　　 下一步我們采用蛋白印跡(western blo

13、t)分析了GSI對(duì)U87及U251細(xì)胞周期蛋白Akt、S6K、CDK2、Cyclin B1和CyclinD1表達(dá)的影響。U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)不同濃度的GSI(1μmol,2.5μmol,5μmol,10μmol)處理48h后,提取不同處理組總蛋白,檢測(cè)Akt、S6K、CDK2、CyclinB1和CyclinD1表達(dá)的表達(dá)。結(jié)果顯示,GSI-Ⅰ作用后兩種細(xì)胞的Akt及S6K的磷酸化程度略有降低。U87細(xì)胞的Cyclin D1表達(dá)下

14、調(diào),U251細(xì)胞的Cyclin B1表達(dá)下調(diào),兩種細(xì)胞的CDK2都有明顯下調(diào)。說(shuō)明GSI-Ⅰ對(duì)膠質(zhì)痛細(xì)胞株的抗凋亡及細(xì)胞周期蛋白的活性及表達(dá)有影響。這可能是GSI-Ⅰ抗膠質(zhì)瘤效應(yīng)的分子機(jī)制之一。從上述結(jié)果分析,GSI-Ⅰ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性作用不僅體現(xiàn)在抑制增殖,還可能直接誘導(dǎo)凋亡。因此,我們進(jìn)一步檢測(cè)了GSI-Ⅰ對(duì)這兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的促凋亡作用。
　　 6.實(shí)驗(yàn)中我們分別用不同濃度度的GSI-Ⅰ作用于U87及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞,

15、作用時(shí)間分別是24h和48h,結(jié)果顯示,GSI作用24h后,隨差GSI濃度的增加,U87細(xì)胞的調(diào)亡率增加(從2.24±0.23％上升到7.63±0.63％),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=116.545,P=0.000),U251細(xì)胞的調(diào)亡率也有增加(從2.72±0.73％上升到6.17±0.45％),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.734,P=0.001),作用48h后,U87和U251細(xì)胞的調(diào)亡率也顯增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為F=144.65

16、1,P=0.000:F=211.295,P=0.000)。以上結(jié)果說(shuō)明GSI-Ⅰ作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞有顯著的促凋亡作用,而該作用在不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中存在差異。U251細(xì)胞較之U87細(xì)胞更容易被GSI-Ⅰ誘導(dǎo)凋亡。
　　 7.我們還進(jìn)一步分析了GSI-Ⅰ、Bleocin和Bleocin+GSI對(duì)U87、U251膠質(zhì)痛細(xì)胞的促凋亡作用,用1 μmol/L GSI-Ⅰ,1μmol/L Bleocin,1μmol/LGSI-Ⅰ+1μmol

17、/L Bleocin處理U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞,用2.5μmol/L GSI-Ⅰ.1 μmol/LBleocin,2.5μmol/L GSI-Ⅰ+lμmol/L Bleocin處理U251細(xì)胞,48h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果顯示,1μmol/L的GSI-Ⅰ對(duì)U87細(xì)胞的調(diào)亡率為9.217±0.440％(P=0.000),1μmol/L的Bleocin對(duì)U87細(xì)胞的調(diào)亡率為8.343±0.778％(P=0.001),1μmol/L

18、GSI-Ⅰ+lμmol/L Bleocin對(duì)U87細(xì)胞的調(diào)亡率為21.160±1.423％(P=0.000)。2.5μmol/L GSI-Ⅰ對(duì)U251細(xì)胞的調(diào)亡率為21.883±2.054％(P=0.000),lμmol/L的Bleocin對(duì)U251細(xì)胞的調(diào)亡率為8.343±0.776％(P=0.015),2.5μmol/L GSI-Ⅰ+1μmol/L Bleocin對(duì)U251細(xì)胞的調(diào)亡率為60.980±2.015％(P=0.000)。