Ubenimex抑制HEXIM1自噬性降解增敏膠質瘤Brd4抑制劑治療.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 膠質瘤細胞對BRD4抑制劑的敏感性與HEXIM1表達水平相關
　　目的：
　　(1)體外實驗論證膠質瘤細胞中HEXIM1表達水平與JQ1敏感性的關系。
　　(2)初步驗證烏苯美司在膠質瘤中是否具有協同BRD4抑制劑的作用，這種作用是否與HEXIM1表達水平相關。
　　方法：
　　(1)采用WST-1法鑒定JQ1在膠質瘤細胞系中的作用。選取3種膠質瘤細胞系

2、進行測試（U87、T98G及U251），將3種細胞株用不同濃度的JQ1（從10nm到5um）處理72小時，72小時后進行細胞增殖實驗，檢測各株細胞對JQ1敏感性的差異。(2)用Western Blot檢測HEXIM1在3種細胞系中的表達，論證HEXIM1表達與JQ1敏感性的相關性;(3)用HEXIMl SiRNA下調HEXIM1在U87M及T98G細胞中的表達（HEXIM1在U251細胞中的基礎表達量非常低，無法對其進行下調實驗）。經W

3、estern Blot驗證HEXIM1表達下調后（圖2A），對HEXIM1下調組(Si-HEXIM1)、空載體組(Si-control)及對照組細胞用JQ1處理后進行WST-1分析，論證干預HEXIM1對膠質瘤細胞株JQ1敏感性的影響。(4)用WST-1法鑒定烏苯美司在膠質瘤細胞對JQ1敏感性中的作用。在加JQ1前先用烏苯美司(0.5mg/ml)預處理膠質瘤細胞48小時，對比烏苯美司預處理組與單用JQ1組的增殖抑制效率。(5)用HEXI

4、Ml SiRNA下調HEXIM1在U87M及T98G細胞中的表達，將HEXIM1 siRNA組，空載體及對照組3組膠質瘤細胞均用烏苯美（0.5mg/ml，48小時）進行預處理，然后再用不同濃度JQ1(10nm～5um)處理72小時，用WST-1法檢測以上細胞的增殖活性。(6)用JQ1或JQ1聯合烏苯美司處理U87M空白對照及HEXIM1下調后的U87M細胞，用AnnexinⅤ-PI染色及流式細胞儀評估上述細胞的凋亡率。
　　結果：

5、
　　(1)JQ1處理后3種膠質瘤細胞株的增值均受到抑制，而且顯示出明顯的計量依賴性，U87M、T98G和U251細胞株的的IC50值分別是65nM、480nM及3010nM。提示:3種膠質瘤細胞系對JQ1顯示出不同的敏感性。(2)HEXIM1在U87M細胞系中表達量最高，而在U251細胞系中表達量最低，提示HEXIM1與膠質瘤對JQ1的敏感性密切相關。(3)U87M、T98G2組膠質瘤細胞系中HEXIM1下調組與對照組相比膠質瘤

6、細胞對JQ1的敏感性均明顯下降，HEXIM1siRNA處理后的U87M及T98G細胞IC50值分別升至110 nM及750nM。(4)單用烏苯美司預處理對3種膠質瘤細胞均無毒性作用，但是烏苯美司可增強膠質瘤細胞對JQ1的敏感性，U87M、T98G及U251的IC50值分別降低至50nM、235nM及830nM。(5)下調HEXIM1能使烏苯美司增強后的JQ1敏感性降低。與烏苯美司預處理的細胞相比，HEXIM1下調后的U87M及T98G細

7、胞株JQ1IC50值分別由原來的50nM、235nM增高至70 nM及380 nM。烏苯美司對空白對照組及HEXIM1下調組細胞的JQ1敏感性均有增強作用。(6)JQ1可誘導U87M細胞凋亡，下調HEXIM1可以使JQ1的促凋亡作用減弱。(7)烏苯美司無論在空白對照組還是HEXIM1下調組細胞中都能夠增強JQ1誘導凋亡的作用。
　　結論：
　　(1)膠質瘤細胞對JQ1敏感性的差異與HEXIM1的表達水平密切相關，通過調節(jié)HE

8、XIM1表達，可以影響膠質瘤細胞對JQ1的敏感性。
　　(2)烏苯美司可增加膠質瘤細胞對JQ1的敏感性，其作用可能與上調HEXIM1表達相關。
　　(3)HEXIM1在JQ1誘導的腫瘤細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，烏苯美司可以增強JQ1的促凋亡作用。
　　第二部分 烏苯美司通過調節(jié)自噬水平、上調HEXIM1的表達增加膠質瘤細胞對JQ1治療敏感性
　　目的：
　　通過體外實驗及體內實驗論證調節(jié)HEXIM1自噬性降

9、解對膠質瘤細胞JQ1敏感性的影響，探索烏苯美司增加膠質瘤細胞對JQ1敏感性的作用機制。
　　方法：
　　(1)使用烏苯美司預處理U87M、T98G和U251三組膠質瘤細胞株，應用western blot的方法檢測烏苯美司處理前后HEXIM1表達的變化，同時測定自噬相關指標P62和LC3B的表達;(2)用電鏡檢測烏苯美司預處理的膠質瘤細胞內自噬小體的變化，進一步驗證自噬;(3)用JQ1及JQ1結合烏苯美司處理U87M膠質瘤細胞

10、，應用免疫組化的方式檢測HEXIM1的表達;(4)使用自噬激活劑雷帕霉素（10nm，與烏苯美司同時應用）激活自噬，應用western blot的方法檢測HEXMI的表達水平的變化;(5)應用對JQ1敏感性較低的T98G和U251細胞株構建荷瘤小鼠模型，分別給予JQ1或JQ1聯合烏苯美司灌胃，處死后稱量腫瘤重量，測量腫瘤體積，體內論證烏苯美司對JQ1抑瘤作用的輔助作用。(6)獲取腫瘤組織后行IHC免疫組化染色，檢測HEXIM1的表達，論證

11、HEXIM1在烏苯美司增敏JQ1治療中的作用。(7)在U251移植小鼠死亡后，對其尸體進行解剖，以觀察肺、肝臟及骨骼是否存在轉移灶，論證烏苯美司對膠質瘤轉移的抑制作用。
　　結果：
　　(1)使用烏苯美司預處理的三組膠質瘤細胞株均表現出顯著的HEXIM1表達上調，同時P62表達上調，LC3B表達降低，提示自噬水平下調。(2)電鏡結果顯示使用烏苯美司預處理的膠質瘤細胞內自噬小體明顯減少。(3)單用JQ1處理不能影響HEXIM1

12、的表達，然而烏苯美司結合JQ1處理膠質瘤細胞導致HEXIM1的表達顯著增加。(4)使用雷帕霉素激活自噬后膠質瘤細胞內HEXMI的表達水平明顯降低。(5)體內實驗表明，經灌胃途徑應用JQ1可以顯著縮小小鼠體內的的腫瘤體積，T98G移植瘤模型對JQ1的敏感性高于U251，與體外研究一致。(6)JQ1聯合烏苯美司口服治療可以使體內腫瘤生長延緩或萎縮速度加快，提示烏苯美司可以增強JQ1控制體內膠質瘤體積的作用。(7)烏苯美司處理后的腫瘤組織HE

13、XIM1的表達增高，與體外實驗結果一致。(8)與單用JQ1相比，聯合烏苯美司口服治療可顯著降低膠質瘤的轉移率(0/20 VS3/20)，而JQ1治療組與對照組(DMSO組)之間無顯著差異(4/20 VS3/20)。
　　結論：
　　(1)烏苯美司抑制膠質瘤細胞內自噬水平，下調HEXIM1自噬性降解，使HEXIM1表達上調。
　　(2)上調膠質瘤細胞自噬水平，可導致HEXIM1自噬性降解水平上調，進而導致HEXIM1表達

14、下調，使膠質瘤細胞株對JQ1敏感性下調。
　　(3)體內試驗進一步證實，烏苯美司可以上調HEXIM1的表達，增強JQ1的抑瘤作用（延緩腫瘤生長、抑制腫瘤轉移）。
　　第三部分 Akt信號通路在烏苯美司增強JQ1敏感性及抑制膠質瘤細胞侵襲性中的作用
　　目的：
　　探討Akt信號通路在烏苯美司增強JQ1敏感性及抑制膠質瘤細胞侵襲性中的作用
　　方法：
　　(1)用Weston Blot檢測烏苯美司處理對

15、膠質瘤細胞Akt信號通路的磷酸化水平的影響。(2)用WST—1細胞增殖及活力實驗論證Akt信號通路在烏苯美司增加膠質瘤JQ1敏感性中的作用。使用Akt激動劑調節(jié)膠質瘤細胞內Akt信號通水平后，觀察烏苯美司對JQ1增敏作用的變化，論證抑制Akt信號通路在烏苯美司增加膠質瘤JQ1敏感性中的作用。(3)使用Transwell實驗論證烏苯美司對膠質瘤細胞侵襲能力的影響，同時使用Akt激動劑調節(jié)膠質瘤細胞內Akt信號通水平后，觀察烏苯美司抑制膠質

16、瘤細胞侵襲能力作用的變化，論證抑制Akt信號通路在烏苯美司抑制膠質瘤侵襲轉移能力中的作用。
　　結果：
　　(1)烏苯美司處理膠質瘤細胞時Akt信號通路的磷酸化水平明顯降低(p-Akt-ser437)。(2)使用Akt激動劑（10nM）后，烏苯美司增加膠質瘤細胞JQ1的敏感性的作用減弱(P＜0.05)，提示抑制Akt信號通路可能是烏苯美司增敏JQ1治療的重要機制之一。(3)Transwell實驗并未發(fā)現JQ1對膠質瘤細胞侵襲

17、能力有顯著促進作用，但是聯合應用JQ1和烏苯美司后可顯著抑制膠質瘤細胞侵襲能力。(4)使用Akt激動劑上調膠質瘤細胞內Akt信號通水平后，烏苯美司抑制膠質瘤細胞侵襲能力的作用被削弱，提示抑制Akt信號通路在烏苯美司抑制膠質瘤侵襲轉移能力中扮演重要角色。
　　結論：
　　(1)抑制Akt信號通路是烏苯美司增強膠質瘤細胞JQ1敏感性的作用機制之一。
　　(2)烏苯美司聯合JQ1可抑制膠質瘤細胞侵襲性，其作用機制與抑制Akt