Ubenimex抑制HEXIM1自噬性降解增敏膠質(zhì)瘤Brd4抑制劑治療.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 膠質(zhì)瘤細(xì)胞對BRD4抑制劑的敏感性與HEXIM1表達(dá)水平相關(guān)
　　目的：
　　(1)體外實(shí)驗(yàn)論證膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HEXIM1表達(dá)水平與JQ1敏感性的關(guān)系。
　　(2)初步驗(yàn)證烏苯美司在膠質(zhì)瘤中是否具有協(xié)同BRD4抑制劑的作用，這種作用是否與HEXIM1表達(dá)水平相關(guān)。
　　方法：
　　(1)采用WST-1法鑒定JQ1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的作用。選取3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系

2、進(jìn)行測試（U87、T98G及U251），將3種細(xì)胞株用不同濃度的JQ1（從10nm到5um）處理72小時，72小時后進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，檢測各株細(xì)胞對JQ1敏感性的差異。(2)用Western Blot檢測HEXIM1在3種細(xì)胞系中的表達(dá)，論證HEXIM1表達(dá)與JQ1敏感性的相關(guān)性;(3)用HEXIMl SiRNA下調(diào)HEXIM1在U87M及T98G細(xì)胞中的表達(dá)（HEXIM1在U251細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)量非常低，無法對其進(jìn)行下調(diào)實(shí)驗(yàn)）。經(jīng)W

3、estern Blot驗(yàn)證HEXIM1表達(dá)下調(diào)后（圖2A），對HEXIM1下調(diào)組(Si-HEXIM1)、空載體組(Si-control)及對照組細(xì)胞用JQ1處理后進(jìn)行WST-1分析，論證干預(yù)HEXIM1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株JQ1敏感性的影響。(4)用WST-1法鑒定烏苯美司在膠質(zhì)瘤細(xì)胞對JQ1敏感性中的作用。在加JQ1前先用烏苯美司(0.5mg/ml)預(yù)處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞48小時，對比烏苯美司預(yù)處理組與單用JQ1組的增殖抑制效率。(5)用HEXI

4、Ml SiRNA下調(diào)HEXIM1在U87M及T98G細(xì)胞中的表達(dá)，將HEXIM1 siRNA組，空載體及對照組3組膠質(zhì)瘤細(xì)胞均用烏苯美（0.5mg/ml，48小時）進(jìn)行預(yù)處理，然后再用不同濃度JQ1(10nm～5um)處理72小時，用WST-1法檢測以上細(xì)胞的增殖活性。(6)用JQ1或JQ1聯(lián)合烏苯美司處理U87M空白對照及HEXIM1下調(diào)后的U87M細(xì)胞，用AnnexinⅤ-PI染色及流式細(xì)胞儀評估上述細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果：

5、
　　(1)JQ1處理后3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的增值均受到抑制，而且顯示出明顯的計量依賴性，U87M、T98G和U251細(xì)胞株的的IC50值分別是65nM、480nM及3010nM。提示:3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系對JQ1顯示出不同的敏感性。(2)HEXIM1在U87M細(xì)胞系中表達(dá)量最高，而在U251細(xì)胞系中表達(dá)量最低，提示HEXIM1與膠質(zhì)瘤對JQ1的敏感性密切相關(guān)。(3)U87M、T98G2組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中HEXIM1下調(diào)組與對照組相比膠質(zhì)瘤

6、細(xì)胞對JQ1的敏感性均明顯下降，HEXIM1siRNA處理后的U87M及T98G細(xì)胞IC50值分別升至110 nM及750nM。(4)單用烏苯美司預(yù)處理對3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞均無毒性作用，但是烏苯美司可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對JQ1的敏感性，U87M、T98G及U251的IC50值分別降低至50nM、235nM及830nM。(5)下調(diào)HEXIM1能使烏苯美司增強(qiáng)后的JQ1敏感性降低。與烏苯美司預(yù)處理的細(xì)胞相比，HEXIM1下調(diào)后的U87M及T98G細(xì)

7、胞株JQ1IC50值分別由原來的50nM、235nM增高至70 nM及380 nM。烏苯美司對空白對照組及HEXIM1下調(diào)組細(xì)胞的JQ1敏感性均有增強(qiáng)作用。(6)JQ1可誘導(dǎo)U87M細(xì)胞凋亡，下調(diào)HEXIM1可以使JQ1的促凋亡作用減弱。(7)烏苯美司無論在空白對照組還是HEXIM1下調(diào)組細(xì)胞中都能夠增強(qiáng)JQ1誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　結(jié)論：
　　(1)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對JQ1敏感性的差異與HEXIM1的表達(dá)水平密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)HE

8、XIM1表達(dá)，可以影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞對JQ1的敏感性。
　　(2)烏苯美司可增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對JQ1的敏感性，其作用可能與上調(diào)HEXIM1表達(dá)相關(guān)。
　　(3)HEXIM1在JQ1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，烏苯美司可以增強(qiáng)JQ1的促凋亡作用。
　　第二部分 烏苯美司通過調(diào)節(jié)自噬水平、上調(diào)HEXIM1的表達(dá)增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對JQ1治療敏感性
　　目的：
　　通過體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)論證調(diào)節(jié)HEXIM1自噬性降

9、解對膠質(zhì)瘤細(xì)胞JQ1敏感性的影響，探索烏苯美司增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對JQ1敏感性的作用機(jī)制。
　　方法：
　　(1)使用烏苯美司預(yù)處理U87M、T98G和U251三組膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，應(yīng)用western blot的方法檢測烏苯美司處理前后HEXIM1表達(dá)的變化，同時測定自噬相關(guān)指標(biāo)P62和LC3B的表達(dá);(2)用電鏡檢測烏苯美司預(yù)處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)自噬小體的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證自噬;(3)用JQ1及JQ1結(jié)合烏苯美司處理U87M膠質(zhì)瘤細(xì)胞

10、，應(yīng)用免疫組化的方式檢測HEXIM1的表達(dá);(4)使用自噬激活劑雷帕霉素（10nm，與烏苯美司同時應(yīng)用）激活自噬，應(yīng)用western blot的方法檢測HEXMI的表達(dá)水平的變化;(5)應(yīng)用對JQ1敏感性較低的T98G和U251細(xì)胞株構(gòu)建荷瘤小鼠模型，分別給予JQ1或JQ1聯(lián)合烏苯美司灌胃，處死后稱量腫瘤重量，測量腫瘤體積，體內(nèi)論證烏苯美司對JQ1抑瘤作用的輔助作用。(6)獲取腫瘤組織后行IHC免疫組化染色，檢測HEXIM1的表達(dá)，論證

11、HEXIM1在烏苯美司增敏JQ1治療中的作用。(7)在U251移植小鼠死亡后，對其尸體進(jìn)行解剖，以觀察肺、肝臟及骨骼是否存在轉(zhuǎn)移灶，論證烏苯美司對膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　(1)使用烏苯美司預(yù)處理的三組膠質(zhì)瘤細(xì)胞株均表現(xiàn)出顯著的HEXIM1表達(dá)上調(diào)，同時P62表達(dá)上調(diào)，LC3B表達(dá)降低，提示自噬水平下調(diào)。(2)電鏡結(jié)果顯示使用烏苯美司預(yù)處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)自噬小體明顯減少。(3)單用JQ1處理不能影響HEXIM1

12、的表達(dá)，然而烏苯美司結(jié)合JQ1處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞導(dǎo)致HEXIM1的表達(dá)顯著增加。(4)使用雷帕霉素激活自噬后膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)HEXMI的表達(dá)水平明顯降低。(5)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)灌胃途徑應(yīng)用JQ1可以顯著縮小小鼠體內(nèi)的的腫瘤體積，T98G移植瘤模型對JQ1的敏感性高于U251，與體外研究一致。(6)JQ1聯(lián)合烏苯美司口服治療可以使體內(nèi)腫瘤生長延緩或萎縮速度加快，提示烏苯美司可以增強(qiáng)JQ1控制體內(nèi)膠質(zhì)瘤體積的作用。(7)烏苯美司處理后的腫瘤組織HE

13、XIM1的表達(dá)增高，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。(8)與單用JQ1相比，聯(lián)合烏苯美司口服治療可顯著降低膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移率(0/20 VS3/20)，而JQ1治療組與對照組(DMSO組)之間無顯著差異(4/20 VS3/20)。
　　結(jié)論：
　　(1)烏苯美司抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)自噬水平，下調(diào)HEXIM1自噬性降解，使HEXIM1表達(dá)上調(diào)。
　　(2)上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬水平，可導(dǎo)致HEXIM1自噬性降解水平上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致HEXIM1表達(dá)

14、下調(diào)，使膠質(zhì)瘤細(xì)胞株對JQ1敏感性下調(diào)。
　　(3)體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，烏苯美司可以上調(diào)HEXIM1的表達(dá)，增強(qiáng)JQ1的抑瘤作用（延緩腫瘤生長、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移）。
　　第三部分 Akt信號通路在烏苯美司增強(qiáng)JQ1敏感性及抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性中的作用
　　目的：
　　探討Akt信號通路在烏苯美司增強(qiáng)JQ1敏感性及抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性中的作用
　　方法：
　　(1)用Weston Blot檢測烏苯美司處理對

15、膠質(zhì)瘤細(xì)胞Akt信號通路的磷酸化水平的影響。(2)用WST—1細(xì)胞增殖及活力實(shí)驗(yàn)論證Akt信號通路在烏苯美司增加膠質(zhì)瘤JQ1敏感性中的作用。使用Akt激動劑調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Akt信號通水平后，觀察烏苯美司對JQ1增敏作用的變化，論證抑制Akt信號通路在烏苯美司增加膠質(zhì)瘤JQ1敏感性中的作用。(3)使用Transwell實(shí)驗(yàn)論證烏苯美司對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，同時使用Akt激動劑調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Akt信號通水平后，觀察烏苯美司抑制膠質(zhì)

16、瘤細(xì)胞侵襲能力作用的變化，論證抑制Akt信號通路在烏苯美司抑制膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力中的作用。
　　結(jié)果：
　　(1)烏苯美司處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞時Akt信號通路的磷酸化水平明顯降低(p-Akt-ser437)。(2)使用Akt激動劑（10nM）后，烏苯美司增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞JQ1的敏感性的作用減弱(P＜0.05)，提示抑制Akt信號通路可能是烏苯美司增敏JQ1治療的重要機(jī)制之一。(3)Transwell實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)JQ1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲

17、能力有顯著促進(jìn)作用，但是聯(lián)合應(yīng)用JQ1和烏苯美司后可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力。(4)使用Akt激動劑上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Akt信號通水平后，烏苯美司抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的作用被削弱，提示抑制Akt信號通路在烏苯美司抑制膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力中扮演重要角色。
　　結(jié)論：
　　(1)抑制Akt信號通路是烏苯美司增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞JQ1敏感性的作用機(jī)制之一。
　　(2)烏苯美司聯(lián)合JQ1可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性，其作用機(jī)制與抑制Akt