交聯(lián)可調式抗結核藥物緩釋型納米人工骨的構建與生物學特性的研究.pdf

1、研究目的:
　　 骨關節(jié)結核是肺外結核中最常見的一種，近年來發(fā)病率有明顯回升的趨勢。根據調查研究，全世界現有的結核病人大約有2000萬人，我國目前的結核病人數占全球的第二位，大約有500萬人左右。在這些結核病患者中，患有骨結核和骨關節(jié)結核的病人約占總人數的1％-2％。
　　 在傳統(tǒng)骨結核的治療中我們往往采用全身早期、規(guī)律、全程、聯(lián)合、適量的原則進行藥物治療。病灶清除手術去除感染壞死組織是局部治療的重要手段，骨關節(jié)結核患者

2、行感染病灶清除術后主要依靠全身抗結核藥物治療，往往術后也立即在病灶局部放置抗結核藥物來加強抗感染治療。不幸的是，由于全身抗結核藥物治療到達病灶局部的藥物濃度較低，甚至在血供不豐富的局部組織抗結核藥物根本無法到達，而局部給藥缺乏明確的用藥指導，常常是一種經驗性治療以至于給藥范圍不均勻、局部藥物濃度過大對正常骨細胞有毒性，加上術后骨缺損局部任然存在炎性病灶，結核分支桿菌對抗結核藥物易產生耐藥性，這些都極大地增加了骨結核復發(fā)和骨缺損移植物修復

3、失敗的風險，最終增加了患者的痛苦和經濟負擔，延長康復時間。因此如何最大化降低術后局部結核病灶的復發(fā)以及促進缺損骨組織的修復是當前骨科醫(yī)生面臨的困境。目前臨床上對于結核病灶清除術后的骨組織缺損盡量采用自體骨移植或軟組織填塞并緩慢鈣化來治療，自體骨移植雖然生物相容性好，融合率高，但來源有限，而且由于局部炎癥反應容易導致移植失?。欢愺w骨、陶瓷、組織工程骨由于生物相容性的因素更易導致局部炎癥的加重，而且極易成為結核桿菌的寄存地。另外，感染病灶

4、清除術后骨組織缺損局部區(qū)域仍存在炎癥反應，而且由于結核桿菌抗結核藥物的抵抗能力強，往往需要長時間持續(xù)給藥才能殺滅結核桿菌或抑制其生長。因此理想的治療策略就是設計具有促進骨缺損組織修復作用并且同時可以長效緩釋抗結核藥物的人工骨填充緩釋材料，這樣就可以在促進骨組織再生修復骨缺損的同時維持局部有效的抗結核藥物濃度，有助于骨移植物周圍骨組織再生同時抑制局部結核桿菌的繁殖，從而避免局部結核病灶的復發(fā)，促進患者的康復。
　　 在目前局部抗結

5、核藥物載體的研究中，比較多見的是高分子有機材料和無機材料，但通常的無機材料雖然機械強度大，化學穩(wěn)定性好但其制備過程中常常需要高溫高壓的條件，從而使抗結核藥物的化學結構和抗藥性受到不同程度的影響，而且目前尚未有負載抗結核藥后長時間緩釋的研究和報道，因此無機物抗結核藥物載體還需進一步探索和研究。
　　 海藻酸鈉(SA)是一種來源于褐藻類的天然有機高分子化合物，具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性。它在鈣離子的作用下可誘

6、導產生自組裝行為，將抗結核藥物與其按一定濃度在氯化鈣溶液中混合后可形成控釋的海藻酸鈉抗結核藥物微球，由于其溫和的溶膠凝膠過程、良好的生物相容性使它適合作為釋放和包埋藥物、蛋白與細胞的載體。
　　 聚乳酸及其共聚物(PLA/PLGA/PCL)是一種典型的合成類可完全降解的高分子有機材料，其降解速率還與組織細胞的生長速率相適應，而且降解產物可參加體內循環(huán)，最終以二氧化碳和水的形式排出體外，對機體和環(huán)境無害，因此具有可靠的生物安全性，

7、并且其具有良好的生物力學性能及易于加工成型等優(yōu)點，目前已廣泛用于生物醫(yī)用材料中，同時也可作為一種較成熟的可降解生物涂層使用。
　　 人工骨支架材料的選擇上，考慮到抗結核藥物緩釋微球的結合和后期動物體內實驗，我們選擇磷酸三鈣生物陶瓷(TPB)這一在臨床上被廣泛應用的成熟的骨替代支架材料。
　　 利福平(RFP)是一種半合成抗生素，具有廣譜抗菌作用，也是抗結核首選藥物之一，通常在臨床上與其他幾種抗結核藥物聯(lián)合使用具有良好的抗

8、癆效果。
　　 綜上所述，本實驗擬將人工骨支架(TPB)與一定濃度的海藻酸鈉(SA)、氯化鈣水溶液、抗結核藥(RFP)相混合，利用海藻酸鈉在鈣離子作用下的自組裝特性制備成人工骨支架/海藻酸鈉抗結核藥物微球復合體(TPB/SA-RFP)，并將此復合體分別用聚乳酸及其共聚物(PLA/PLGA/PCL)表面涂層化處理，從而最終制備出交聯(lián)可調式抗結核藥物緩釋型納米人工骨復合體(TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL)。而后觀測復

9、合體的微觀結構、通過體外測定復合體的緩釋特性進而確定在制備TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復合體時最佳海藻酸鈉/氯化鈣質量百分比、最佳利福平濃度、通過體外細胞毒性測定確定最佳聚乳酸類緩釋涂層材料，然后在動物體內測定TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復合體的毒性、血藥濃度以及成骨效應等一系列理化性質，從而為最終能實際應用于臨床中提供理論依據和實驗支持。
　　 研究方法:
　　 1：TPB/SA-R

10、FP/PLA-PLGA-PCL復合體的制備，以及復合體形態(tài)結構，藥物緩釋特性、細胞毒性的檢測。方法：以TPB(磷酸三鈣生物陶瓷)和利福平為原材料，將其浸沒于一定濃度的海藻酸鈉/氯化鈣利福平水溶液中；通過海藻酸鈉與鈣離子的凝膠化作用，將負載的利福平包封在磷酸三鈣生物陶瓷內制備成TPB/SA-RFP抗結核藥物微球復合體，然后將此復合體分別浸沒于一定濃度的PLA/PLGA/PCL溶液中，最后取出干燥、去除溶劑，從而最終制備出TPB/SA-RF

11、P/PLA-PLGA-PCL復合體。在掃描電鏡下觀測晶相組成、微觀形貌。用紫外分光光度計測定利福平在不同濃度的海藻酸/氯化鈣水溶液中的緩釋效能，來確定最佳海藻酸鈉/氯化鈣質量百分比。測定不同濃度的利福平在海藻酸鈉/氯化鈣水溶液中的誘導效率(EE)和負載效率(LE)來確定最佳的利福平濃度。分別測定體外利福平在TPB/SA-RFP/PLA，TPB/SA-RFP/PLGA，TPB/SA-RFP/PCL復合體中的緩釋時間，來確定哪一種聚乳酸類緩

12、釋涂層材料的緩釋時間最長。體外細胞毒性試驗，以MC-3T3為試驗細胞，分別測定空白組(單純TPB)、陽性組(RFP直接給藥)、實驗組TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL，復合體對MC-3T3的毒性，進一步確定TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復合體是否具有可靠的生物安全性，以及最佳的聚乳酸類緩釋涂層材料。
　　 2：TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復合體的體內動物實驗。方法：以新西蘭大白兔為試

13、驗動物，分組建立兔股骨骨缺損模型，將TPB/SA-RFP/PLA、TPB/SA-RFP/PLGA復合體作為實驗組，將TPB作為空白對照組植入缺損部位，術后監(jiān)測其生命體征、傷口愈合及肢體活動情況。在術后1天、3天、5天、7天、14天、28天、42天對靜脈血標本進行血藥濃度的測定，分批在4周、8周、12周空氣注射法處死并取出股骨大體標本，對大體標本進行X光掃描、固定后組織染色和免疫組化定性分析，進而確定抗結核藥在該復合體植入體內后的血藥濃度

14、變化以及成骨誘導性能。
　　 結果:
　　 1、TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復合體呈多孔結構、大小均勻、排列有序，有較低的結晶度在體內更易降解，該材料具有更好的化學穩(wěn)定性。制備TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復合體時最佳的海藻酸鈉/氯化鈣質量百分比是1％，最佳利福平濃度是1mg/mL，聚乳酸類緩釋涂層材料中PLA最優(yōu)，PCL與PLGA無明顯差異，RFP在TPB/SA-RFP/PLA-PLG

15、A-PCL復合體外緩釋時間>30天、緩釋濃度>MIC值。細胞毒性實驗顯示海藻酸鈉/聚乳酸類涂層材料無毒性，生物相容性好，并且能明顯促進MC3T3-E1細胞的早期粘附、增殖以及晚期增殖的作用(P<0.01)。
　　 2、TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復合體動物體內實驗結果表明，RFP在TPB/SA-RFP/PLA復合體植入動物體內42天后任維持一定的有效血藥濃度，TPB/SA-RFP/PLA、TPB/SA-RFP/

16、PLGA復合體對成骨作用明顯，海藻酸鈉/聚乳酸類材料的加入對TPB骨支架材料的成骨性能未有明顯的抑制和破壞作用，TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復合體材料具有明顯的骨重建和充填功能，有望被用來重建骨結核病灶清除后的骨缺損殘腔。
　　 結論:
　　 TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復合體實驗室合成方便，載藥量大，包封率高，體外試驗結果表明其緩釋性能良好，緩釋時間較長，療效明顯，TPB/SA-RF