差異表達小RNA及其下游靶基因與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究.pdf

1、本研究通過比較胃癌原發(fā)灶與配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中小RNA表達譜，尋找差異表達小RNA，并檢測其在胃癌原發(fā)灶中的表達量，研究差異表達小RNA與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。最后通過生物信息學方法預測其靶基因，研究小RNA參與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的下游通路，旨在為胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制研究探尋潛在的靶基因。
　　一、激光捕獲顯微切割純化腫瘤與RNA質(zhì)檢體系的建立
　　目的：建立激光顯微切割純化腫瘤與微量RNA提取、質(zhì)檢的標準流程，為后續(xù)實驗提供質(zhì)量可

2、靠的RNA標本。方法：使用紫外分光光度儀、瓊脂糖凝膠電泳、real-time PCR檢測不同離體時間正常胃粘膜中RNA降解的情況。選取5例胃癌原發(fā)灶及配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，使用激光捕獲顯微切割獲得純化腫瘤標本，紫外分光光度儀、瓊脂糖凝膠電泳、Agilent2100生物分析儀檢測純化標本的RNA質(zhì)量。結(jié)果：抽提自離體時間分別為0’，15’，30’，60’，120’，240’的胃正常粘膜中的總RNA未見明顯降解；miR-125b、U6、18S和

3、GAPDH在0’和240’兩組中的表達量無明顯差異。激光捕獲顯微切割8um厚切片10mm2能獲得606-1038ng的總RNA量，激光捕獲顯微切割標本中存在總RNA降解。Agilent2100生物分析儀檢測見激光捕獲顯微切割標本中總RNA降解，但小RNA水平未見明顯降解。結(jié)論：離體時間在240’內(nèi)的正常胃粘膜中總RNA無明顯降解；總RNA水平的降解并不指示小RNA水平的降解；激光捕獲顯微切割所獲總RNA質(zhì)與量滿足后續(xù)實驗要求。
　

4、　二、胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶間差異表達小RNA篩選及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系分析
　　目的：尋找胃癌原發(fā)灶與配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶間差異表達的小RNA，研究差異表達小RNA在胃癌組織標本中的表達情況及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：使用小RNA芯片檢測5例胃癌原發(fā)灶與配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，尋找差異表達的小RNA。使用Stem-100p RT-PCR檢測33例胃癌患者術(shù)后標本中差異表達小RNA的表達情況，并統(tǒng)計其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果：小RN

5、A芯片共檢測到5個表達有統(tǒng)計學差異的小RNA，相對原發(fā)灶，miR-24-1*、miR-510、miR-1284在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中低表達，miR-10a、miR-1259在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中高表達。miR-10a、miR-24-1*、miR-510在33例胃癌原發(fā)灶中的表達量檢測顯示，miR-10a在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶中的表達量低于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(p=0.047)，但在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶中，miR-10a表達量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度無相關(guān)性。

6、結(jié)論：在胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中檢測到miR-10a、miR-24-1*、miR-510、miR-1259、miR-1284等5個差異表達小RNA，其中miR-10a在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶中較不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達低，但其表達量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度無相關(guān)性。
　　三、差異表達小RNA的靶基因預測與篩選
　　目的：預測差異表達小RNA的靶基因，研究小RNA參與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的下游通路，為后續(xù)研究小RNA調(diào)控的胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移通路

7、提供潛在分子目標。方法：使用TargetScan預測miR-10a、miR-24-1*和miR-510的靶基因，檢索已發(fā)表的胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因譜或蛋白質(zhì)譜相關(guān)研究，對比優(yōu)化小RNA的靶基因預測。結(jié)果：使用TargetScan分別為miR-10a、miR-24-1*和miR-510預測到186個、438個和62個靶基因。結(jié)合已發(fā)表文獻，進一步篩選得miR-10a靶基因CDK6、TPM4：miR-24-1*靶基因PURA；miR-510

8、靶基因EGR1。結(jié)論：經(jīng)生物信息學方法獲得miR-10a靶基因CDK6、TPM4；miR-24-1*靶基因PURA；miR-510靶基因EGR1。
　　四、小結(jié)
　　經(jīng)激光捕獲顯微切割獲得的RNA標本質(zhì)與量均滿足后續(xù)小RNA研究的要求。小RNA芯片檢測到胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶間miR-10a、miR-24-1*、miR-510、miR-1259、miR-1284等5個差異表達小RNA，其中miR-10a在胃癌原發(fā)灶中的表達