siDrosha穩(wěn)定細胞系的建立以及miR491-5p誘導胰腺癌細胞凋亡作用機制的研究.pdf

1、碩士學位論文(專業(yè)學位)siDrosha穩(wěn)定細胞系的建立以及miR491—5p誘導胰腺癌細胞凋亡作用機制的研究所院：姓名：指導教師：j日寸形(J，：學科專業(yè)：研究方向：完成日期：北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所郭蓉劉力病原生物學基因表達調控2012年5月北京協(xié)利醫(yī)。T一]，a、t碩一卜學何論文中文摘要MicroRNA(miRNA)是一類隸屬于非編碼RNA(non—codingRNA)大家族并可在轉錄后水平調控基因表達的

2、重要小分子，長度為21～23個核苷酸，可以通過誘發(fā)mRNA降解或抑制蛋白翻譯的方式負調控靶基因。到目前為止，在人類基因組中已經確定的miRNA有650個以上，它們參與調控人類30％的蛋白表達。miRNA分子參與了包括發(fā)育、細胞分化、細胞凋亡、代謝和癌癥等多種生理病理過程?；趍iRNA的重要功能，近年來對miRNA的功能研究己成為科學研究的熱點之一。在miRNA的生物合成過程中，Drosha酶起到了非常重要的作用，它是RNaselII家

3、族的成員，介導從primiRNA到～70ntpre—miRNA的加工過程。Drosha基因突變后，將會影響miRNA的『F常生物合成，因此，建立Drosha基因突變細胞模型，有助于研究一些miRNA的生物學功能。本課題第一部分利用RNAi實驗方法構建了293一siDrosha穩(wěn)定細胞系，并探討該穩(wěn)定細胞系在miRNAs功能研究中的應用。具體研究如下：(1)將質粒pSicoRhumanDroshal轉入人胚腎293細胞，用G418篩選2—

4、3周后，獲得293siDrosha#3穩(wěn)定細胞系。(2)用RTPCR、Westernblotting、real—timePCR等方法檢測293一siDrosha#3穩(wěn)定細胞系中Drosha基因mRNA和蛋白質表達情況。(3)用poly(A)實時定量RTPCR方法檢測野生型293細胞，Mix細胞(未克隆的293一siDrosha細胞)，293siDmsha#3細胞(克隆的293一siDrosha細胞)中內源hsa—miR4915p的表達情

5、況。本實驗結果表明：(1)構建的293siDrosha#3穩(wěn)定細胞系與對照組相比，293siDrosha#3細胞中Drosha基因的mRNA和蛋白質表達水平均顯著下降。(2)通過檢測內源性hsamiR4915p在對照組和293一siDrosha#3細胞中表達情況，表明對照組細胞中表達的hsamiR4915p是293siDrosha#3細胞的近120倍。本實驗成功構建了293siDrosha穩(wěn)定細胞系，并且證明此穩(wěn)定細胞系可以作為研究一些

6、microRNAs相關功能的模式細胞系。因為miRNA可以調控人類的生長發(fā)育、生理、病理狀態(tài)，因此體液中廣泛存在的miRNA可能作為研究人類生理和疾病狀態(tài)的新的有效生物標志物。已經有研究表明在正常組織與病理組織中miRNA表達水平存在差異，即使是同一組織不同的分化時期，miRNA表達水平也不相同。這種差異表達也發(fā)生在腫瘤特異性miRNA上，從而幫助診斷腫瘤的組織來源和特定的腫瘤分型。研究表明miRNA對正常細胞的增殖有促進或抑制作用，因