TRAIL及其受體在ATRA誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、背景和目的：維甲酸類藥物可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡已得到證實(shí)，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)則由于其選擇性誘導(dǎo)腫瘤凋亡的特性而倍受重視。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)全反式維甲酸(ATRA)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)atu8988有誘導(dǎo)凋亡作用，通過(guò)GEArray<’TM> Q基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)ATRA使TRAIL受體表達(dá)上調(diào)。本研究將在此基礎(chǔ)上試圖進(jìn)一步闡明ATRA促進(jìn)多種人胰腺癌細(xì)胞株凋亡的作用機(jī)制，并建立胰腺癌動(dòng)物模型期望在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中加以

2、證實(shí)。同時(shí)研究TRAlL及其受體在ATRA誘導(dǎo)前后表達(dá)的變化。通過(guò)轉(zhuǎn)染pCAl3/TRAIL質(zhì)粒研究TRAIL促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用。并進(jìn)一步觀察ATRA和TRAIL在誘導(dǎo)凋亡和調(diào)控TRAIL受體上有無(wú)協(xié)同作用。 方法：用MTT方法觀察不同濃度ATRA對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SWl990、Patu8988和Bx-PC3活性的影響。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)ATRA誘導(dǎo)24、48和72h后細(xì)胞的凋亡率，并通過(guò)TUNEL和Hoechst雙染、透

3、射電鏡觀察證實(shí)凋亡的存在。將SWl990和Bx-PC3細(xì)胞接種于裸鼠皮下，成瘤后在裸鼠體內(nèi)擴(kuò)增傳代，建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型，然后分別給予ATRA 40mg/kg每曰口服或400nmol隔日瘤內(nèi)注射，并設(shè)無(wú)干預(yù)組和空白溶劑組，每周兩次觀察移植瘤的大小變化，繪制移植瘤生長(zhǎng)時(shí)間曲線。4-6周將裸鼠處死，取瘤稱重，根據(jù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組瘤重計(jì)算抑瘤率。對(duì)移植瘤組織進(jìn)行HE染色、電鏡觀察、nYNEL和Hoechst雙染、免疫組化檢測(cè)Caspase-

4、3和TRAIL-R1、R2的表達(dá)，抽提細(xì)胞、組織的RNA和蛋白通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)TRAIL mRNA和蛋白的表達(dá)。通過(guò)免疫組化和流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)算胰腺癌細(xì)胞株ATRA誘導(dǎo)前后TRAIL-R1、R2的變化。經(jīng)酶切及PCR鑒定證實(shí)后，轉(zhuǎn)染pCA13/TRAIL質(zhì)粒，用GFP法測(cè)轉(zhuǎn)染效率，設(shè)空質(zhì)粒對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后24h加或不加ATRA誘導(dǎo)24h和48h，MTT法測(cè)活性，電鏡觀察、TUNEL和Hoechst雙染、免疫

5、組化檢測(cè)Caspase-3證實(shí)凋亡的存在，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、周期、TRAIL-R1、2的變化。 結(jié)果：MTT法顯示ATRA對(duì)三種人胰腺癌細(xì)胞株SWl990、Patu8988和Bx-PC3的生長(zhǎng)均有顯著抑制作用，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。ATRA誘導(dǎo)后TUNEL和Hoechst雙染、透射電鏡觀察證實(shí)凋亡的存在，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示誘導(dǎo)24h后細(xì)胞凋亡率在10-30％，并隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。通過(guò)腫瘤細(xì)胞皮下接種，體

6、內(nèi)擴(kuò)增傳代的方法成功建立了兩種胰腺癌細(xì)胞株裸鼠移植瘤模型。ATRA40mg／kg口服和400nmol瘤內(nèi)注射后移植瘤體積和瘤重均明顯小于對(duì)照組(P<0.05)，Bx-PC3抑瘤率為64.24％和55.78％，SWl990為44.03％和49.13％。移植瘤組織HE染色、電鏡觀察可見腫瘤細(xì)胞形態(tài)改變及誘導(dǎo)后凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)。ATRA干預(yù)后細(xì)胞、組織內(nèi)TUNEL和Hoechst雙染、免疫組化檢測(cè)Caspase-3和TRAIL-R1、2陽(yáng)性率均

7、高于對(duì)照。ATRA誘導(dǎo)后TRAIL mRNA和蛋白的表達(dá)增加。轉(zhuǎn)染TRAIL質(zhì)粒后SWl 990、Patu8988和Bx-PC3轉(zhuǎn)染效率分別為69.88±9.92％、26.52±10.01％和38.60±11.02％，TRAILmRNA和蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)染后24h出現(xiàn)，48h達(dá)高峰。轉(zhuǎn)染pCAl3／TRAIL質(zhì)粒凋亡率和TRAIL-R1、2陽(yáng)性率高于空質(zhì)粒組，細(xì)胞周期主要被阻滯于GO／G1期。聯(lián)用ATRA后，進(jìn)一步促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞株的凋亡，

8、但TRAIL-R1、2的表達(dá)并無(wú)進(jìn)一步增加。 結(jié)論：成功建立了兩種人胰腺癌細(xì)胞株裸鼠移植瘤模型。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ATRA對(duì)多種人胰腺癌細(xì)胞株有誘導(dǎo)凋亡的作用，并能抑制腫瘤的生長(zhǎng)。TRAIL能將細(xì)胞周期阻滯在GO／G1期，上調(diào)其受體1、2，活化Caspase-3，促使細(xì)胞凋亡。ATRA上調(diào)TRAIL及其受體1、2，通過(guò)TRAIL依賴的凋亡途徑促使細(xì)胞凋亡，但這并非ATRA誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的唯一途徑。聯(lián)用ATRA和TRAIL進(jìn)