肝臟再生調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子間相互作用網(wǎng)絡(luò)的初步研究.pdf

1、肝臟是人類少數(shù)具有再生能力的器官之一，肝臟再生是生物體進(jìn)化而來的一種自我保護(hù)措施。目前對(duì)于肝臟再生研究表明，肝臟再生過程可以分為三個(gè)階段，即啟動(dòng)、再生與終止，但這三個(gè)階段的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制均尚未被徹底闡明。對(duì)于肝臟再生的認(rèn)識(shí)也經(jīng)歷了三個(gè)過程，首先人們認(rèn)為肝臟再生過程是以某一個(gè)蛋白因子為開關(guān)，一旦觸動(dòng)這個(gè)開關(guān)，肝臟再生過程就按照設(shè)計(jì)好的程序依次展開，直到再生完成而終止；后來人們認(rèn)識(shí)到這個(gè)過程的復(fù)雜性，不是某一個(gè)蛋白能夠決定的，而是某一條通路

2、起到關(guān)鍵作用，但是事實(shí)上依然解釋不了這個(gè)過程中的眾多謎團(tuán)；最后，人們認(rèn)識(shí)到肝臟再生遠(yuǎn)比想象的還要復(fù)雜，它是一個(gè)多條信號(hào)通路參與、相互影響、相互作用的最終結(jié)果。在上述不同階段的理論指導(dǎo)下，以往對(duì)于肝臟再生的研究都集中在某一個(gè)或幾個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞因子或通路，而近來的研究則更注重宏觀層面的研究，試圖從全基因組來認(rèn)識(shí)這個(gè)現(xiàn)象。本文在這種研究背景之下，采用酵母雙雜交的方法繪制了肝臟再生過程中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白相互作用圖譜，試圖從蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的整體水

3、平揭開肝臟再生的秘密。 本文研究?jī)?nèi)容及結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面： 1.肝臟再生過程中轉(zhuǎn)錄因子的篩選：首先，在全基因組水平篩選調(diào)控肝臟腫瘤細(xì)胞株SMMC7721生長(zhǎng)的重要基因，共篩選了29，910個(gè)ORFs對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激或抑制作用。通過單個(gè)ORF轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)一批能夠控制細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，其中包括129個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室還采用小鼠CCl4導(dǎo)致肝損傷的模型，以gene chip@ mouse4302.

4、0芯片檢測(cè)了肝損傷過程中mRNA水平的基因表達(dá)譜。以芯片數(shù)據(jù)分析即mRNA的表達(dá)水平變化，以及上述細(xì)胞生長(zhǎng)篩選出的129個(gè)轉(zhuǎn)錄因子為基礎(chǔ)，選擇了32個(gè)既能夠刺激或抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，又在肝臟再生過程有表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)的變化的ORFs，包括27個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和5個(gè)磷酸激酶。經(jīng)過這兩個(gè)條件篩選，選擇的32個(gè)ORFs編碼蛋白與肝臟再生的調(diào)控被認(rèn)為密切相關(guān)。 2.轉(zhuǎn)錄因子相互作用網(wǎng)絡(luò)的繪制：首先，將32個(gè)ORFs分別克隆到載體pGADT7(A

5、D)和pGBKT7(BD)，然后分別轉(zhuǎn)化到酵母株AH109與Y187，經(jīng)氨基酸缺陷培養(yǎng)基篩選陽性克隆后，分別得到32個(gè)“誘餌”和“獵物”蛋白。第二步將每一個(gè)“誘餌”蛋白與每一個(gè)“獵物”蛋白進(jìn)行報(bào)告基因自激活檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)三個(gè)“誘餌”蛋白和兩個(gè)“獵物”蛋白即BD-HBP1、BD-STAT3、BD-FOXM1、AD-FOXM1、AD-REA具有自激活能力，故這幾個(gè)“誘餌”和“獵物”蛋白被排除在下一步一對(duì)一矩陣雜交之外；通過870次酵母雙雜交-

6、矩陣雜交實(shí)驗(yàn)，采用HIS3、LacZ、ADE2三個(gè)報(bào)告基因的平行測(cè)試，共發(fā)現(xiàn)64對(duì)相互作用，即至少激活一個(gè)報(bào)告基因的表達(dá)，依據(jù)對(duì)報(bào)告基因激活程度的鑒定又將這些相互作用按照強(qiáng)度分為I、II、III和IV四類，共得到18對(duì)I級(jí)、9對(duì)II級(jí)、21對(duì)III級(jí)和16對(duì)IV級(jí)相互作用，最后運(yùn)用這些數(shù)據(jù)繪制出一張與肝臟再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。 3.轉(zhuǎn)錄因子相互作用網(wǎng)絡(luò)質(zhì)量的驗(yàn)證：為了驗(yàn)證蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的可靠性和真實(shí)性，采用與其它蛋白

7、互作圖譜比較、體外結(jié)合試驗(yàn)以及β-半乳糖苷酶活性定量測(cè)定的辦法檢驗(yàn)了該網(wǎng)絡(luò)的質(zhì)量。通過與其它蛋白互作圖譜對(duì)比發(fā)現(xiàn)，選擇的32個(gè)ORFs中多個(gè)沒有被提及，但是結(jié)果與已發(fā)表的結(jié)果相比有很高的相似性：通過免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)與谷光苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn)(Glutathionine-S-transferase Pull-down，GST Pull-down)對(duì)通過酵母雙雜交獲得的64對(duì)相互作用中

8、的13對(duì)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。將這13對(duì)互作的ORFs克隆到真核表達(dá)與原核表達(dá)載體，分別在大腸桿菌和HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，然后運(yùn)用Co-IP和GST Pull-down方法，證實(shí)了其中11對(duì)相互作用；采用β-半乳糖苷酶活性定量測(cè)定的辦法不僅再一次驗(yàn)證了互作，還量化了相互作用激活報(bào)告基因的程度。通過以上實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了酵母雙雜交所獲得的相互作用的基本可靠性，以及由此繪制出的肝臟再生過程中轉(zhuǎn)錄因子互作網(wǎng)絡(luò)的真實(shí)可靠性。 4.轉(zhuǎn)錄因子相

9、互作用網(wǎng)絡(luò)在肝臟再生過程中的作用分析：對(duì)于肝臟再生過程中轉(zhuǎn)錄因子間的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究，其最終目的是為了進(jìn)一步深化對(duì)肝臟再生的理解。本文通過分析肝臟再生過程中與STAT3和ATF3可能發(fā)生互作的所有蛋白以及該兩種轉(zhuǎn)錄因子在肝臟再生過程的作用，把STAT3和ATF3作為調(diào)控肝臟再生蛋白互作網(wǎng)絡(luò)研究的切入點(diǎn)，并推測(cè)FHL-2-ATF3和FHL2-STAT3的互作在肝臟再生過程中起到抑制再生的作用；鑒于32個(gè)ORFs大多數(shù)都具有抑制肝癌細(xì)

10、胞增值的功能，并且絕大多數(shù)互作蛋白對(duì)中至少有一個(gè)蛋白具有抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的特性。因此，我們繪制的網(wǎng)絡(luò)可能起到抑制肝臟再生的作用。FHL2與ATF3之間的相互作用，是本論文首次發(fā)現(xiàn)的，它可能在調(diào)控肝臟再生后期結(jié)束再生的過程中擔(dān)任重要角色，目前這對(duì)相互作用在體內(nèi)的驗(yàn)證工作正在進(jìn)行中。 5.轉(zhuǎn)錄因子相互作用網(wǎng)絡(luò)的后續(xù)研究：尋找相互作用結(jié)構(gòu)域是研究蛋白互作的常用及有效方法。本研究中發(fā)現(xiàn)，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，如FHL2、ZNF408、ID3與

11、ZNF212等，能夠與眾多蛋白發(fā)生互作，在網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位，即所謂的Hub蛋白。所以本文對(duì)其中的。FHL2-ATF3、ZNF408-ZNF408這兩對(duì)作用位點(diǎn)進(jìn)行了深入研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FHL2與ATF3這對(duì)相互作用中，F(xiàn)HL2的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域(即半個(gè)Lim)起主要的作用，而ATF3的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和抑制結(jié)構(gòu)域均起到了作用；在ZNF408的自作用中，ZNF408中間的鋅指重復(fù)序列起到了關(guān)鍵作用；為了擴(kuò)大PPI網(wǎng)絡(luò)的信息量，用DLK和FP

12、248篩選了人肝臟cDNA文庫，得到近700個(gè)克隆，待下一步測(cè)序驗(yàn)證互作的蛋白。 綜上所述，本文采用酵母雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)與肝臟再生相關(guān)的調(diào)控肝細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)錄因子間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；通過多種實(shí)驗(yàn)手段對(duì)網(wǎng)絡(luò)的質(zhì)量進(jìn)行了驗(yàn)證；提出了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)對(duì)肝臟再生的調(diào)控機(jī)制；對(duì)轉(zhuǎn)錄因子相互作用網(wǎng)絡(luò)后期的深入研究進(jìn)行了初步探索；本研究為轉(zhuǎn)錄因子相互作用網(wǎng)絡(luò)的生理活性研究奠定了基礎(chǔ)，為肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了嶄新的思路，初步為我們最終理解肝臟再生