靶向腫瘤的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒（mimoretrovirus）介導的針對人POKEMON基因的RNAi策略在宮頸癌基因治療中的作用研究.pdf

1、宮頸癌是最常見的惡性腫瘤之一，由于腫瘤疾病的本質(zhì)是“基因病”，宮頸癌也不例外，故從理論上講，從基因水平來解決癌癥問題是最佳途徑。siRNA能夠高效、特異地抑制靶基因的表達，已經(jīng)成為應用于臨床疾病尤其是腫瘤防治研究的有力工具。但是，對于RNAi應用到腫瘤的基因治療而言，涉及到靶基因的選擇和體內(nèi)遞送系統(tǒng)(宿主細胞的高效定向轉(zhuǎn)運)等非常關(guān)鍵的問題。從目前國外文章報道情況來看，這些問題并沒有很好地解決。所以，要解決用RNAi策略解決腫瘤的基因治

2、療問題，必須綜合考慮這些問題才能真正使之將來應用于臨床。 在靶基因的選擇問題上，由于腫瘤的發(fā)生涉及到體內(nèi)諸多重要分子，而且這些分子在體內(nèi)形成一個或多個復雜的網(wǎng)絡(luò)。有些分子可能是位于這個網(wǎng)絡(luò)的中下游，是具體執(zhí)行細胞轉(zhuǎn)化(transformation)或轉(zhuǎn)化之后的某些功能的分子。如果對這些分子進行“基因沉默”，腫瘤細胞有可能通過其它支路或旁路進行信號轉(zhuǎn)導而達到細胞轉(zhuǎn)化的目的。基于此，雖然我們目前還不知道這個網(wǎng)絡(luò)頂層的具體分子，但是如

3、果我們對目前已知的位于最頂層的重要分子進行干預則應該會取得更好的效果。所以在我們的實驗中選擇了Pokemon原癌基因作為RNAi的靶標。Pokemon(forPOKerythroidmyeloidontogenicfactor)，發(fā)現(xiàn)于2005年，其在細胞分化中具有多種非常關(guān)鍵的功能，并且同其它POK家族成員如BCL6有物理性接觸。已有的證據(jù)已經(jīng)證明了其是腫瘤發(fā)生的一個關(guān)鍵因素。在人類多種腫瘤中該基因異常高表達。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其作用模式為

4、：Pokemon↑↑→ARF↓→MDM2→p53↓→腫瘤發(fā)生。所以，Pokemon的作用是位于許多腫瘤抑制基因和原癌基因的上游，故將其作為靶基因?qū)⒂兄趯δ[瘤的根治。 第二個關(guān)鍵問題是siRNAs的體內(nèi)定向遞送問題。這也是制約RNAi技術(shù)在體內(nèi)應用的瓶頸之一。由于Pokemon蛋白的作用與細胞的分化、腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，所以在正常組織中不可避免地或多或少地存在，如果對機體所有組織細胞的Pokemon基因表達進行干擾可能會對正常組

5、織分化、發(fā)育等生理過程帶來負面影響。我們認為通過siRNAs向腫瘤組織特異靶向遞送可以一方面避免這種負面影響，另一方面也可以有效地利用好有限的siRNAs資源，從而提高腫瘤基因治療的效率。選擇性地表達在腫瘤細胞及腫瘤組織新生血管上的整合素αvβ3的三肽Arg-Gly-Asp(RGD)能夠把化學合成定向帶到腫瘤組織部位，并取得較好的腫瘤治療效果。但是化學合成siRNAs費用昂貴，并且還有作用時間不會太長(因為RNA在體內(nèi)很容易被降解)和實

6、際操作困難的問題(因為RNA水平的操作遠較DNA水平操作麻煩)。并不適用于腫瘤防治這樣一個長期的過程。逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)可以解決這個問題。逆轉(zhuǎn)錄病毒可以將其基因組插入到腫瘤細胞基因組中，并將從此長期存在，其效應也會與其相伴隨。這也是逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)在RNAi領(lǐng)域和腫瘤治療研究領(lǐng)域倍受關(guān)注的原因。但是，同其它病毒一樣，逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備過程仍很復雜，并且制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度仍是困擾實驗進程的關(guān)鍵因素，并且它也沒有組織靶向性。另外，由于病毒的成分復

7、雜，其實際臨床應用時將面臨諸多疑問。 基于此，我們將上述幾種設(shè)想進行了整合，進行了以下實驗： (一)針對Pokemon基因的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定首先從Genebank中獲取Pokemon原癌基因mRNA序列全長，通過Ambion公司在線設(shè)計工具，設(shè)計了4對針對Pokemon的siRNA序列，并將其分別定向克隆入pSilencer5.1-H1Retro逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，并且將表達載體的線性載體的粘

8、性末端用Klenow酶補平后，再連接起來構(gòu)建了空載體對照質(zhì)粒，經(jīng)過雙酶切、及測序鑒定，確定了所構(gòu)建的重組PokemonsiRNAs表達質(zhì)粒及空載體對照質(zhì)粒是完全成功的。 (二)各重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒對Pokemon基因沉默效應的檢測及其對Hela細胞生物學性狀的改變?nèi)缓?，將所?gòu)建的重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染Hela細胞，經(jīng)過嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染4個編碼不同siRNA序列重組質(zhì)粒及空載體對照質(zhì)粒的Hela細胞。經(jīng)過Q-PCR以及WB檢測

9、，觀察了轉(zhuǎn)染不同siRNA表達質(zhì)粒后，Hela細胞中Pokemon基因的表達情況。并且應用MTT、凋亡關(guān)鍵酶Capase3/7活性檢測、以及transwell侵襲性檢測等方法，檢測了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，Hela細胞生物學性狀的改變，進一步驗證了Q-PCR及WB的結(jié)果，篩選出沉默效應最好的siRNA序列。Q-PCR及WB結(jié)果顯示：與未轉(zhuǎn)染組Hela細胞相比，轉(zhuǎn)染編碼GTCCTCGTCCTTAAAGTGC的HpsiRNA-4的Hela細胞中

10、，Pokemon基因表達下降了83％，同時對其增殖速率、以及侵襲性等生物學性狀的觀察也發(fā)現(xiàn)，其增殖速度為未轉(zhuǎn)染Hela細胞的65％，侵襲性減弱為30％，其凋亡關(guān)鍵酶活性則上升為未轉(zhuǎn)染組的2.2倍。從上述結(jié)論看來，通過對Hela細胞中Pokemon基因的沉默，可以促使Hela細胞的表型呈良性轉(zhuǎn)變，為后期的在體腫瘤預防性實驗和治療性實驗提供了實驗基礎(chǔ)。 (三)針對POKEMON基因的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒及其模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備為了嘗

11、試解決siRNAs體內(nèi)定向遞送的問題，我們利用本教研室已經(jīng)研制的富含正電荷的mimovirus多聚賴氨酸系統(tǒng)，它可以通過電荷間的相互作用與帶負電荷的DNA自組裝形成納米級病毒樣顆粒。并將靶向腫瘤及腫瘤新生血管的三肽Arg-Gly-Asp(RGD)整合其中，設(shè)計了momiretrovirus的多肽包裝系統(tǒng)，在RGD肽與多聚賴氨酸的連接方式上采用了直接連接和柔性Linker連接兩種方式，其序列為KKKKKKKKKKKKKKKKKK-ACRG

12、DMFGCA(直接連接)和KKKKKKKKKKKKKKKKKK{acp}S{acp}S{acp}SACRGDMFGCA(柔性Linker連接)，上述多肽包裝系統(tǒng)在HBS緩沖液中與重組質(zhì)粒可以自組裝形成了20nm大小的病毒樣顆粒，我們通過了不同電荷比情況下，靶向腫瘤的多聚賴氨酸系統(tǒng)對重組siRNA表達質(zhì)粒的包被情況以及所形成的病毒樣顆粒的大小。并且通過DNaseⅠ保護實驗檢測了我們所設(shè)計的靶向腫瘤的多聚賴氨酸系統(tǒng)對核酸酶的抵抗作用。在體外

13、實驗中，初步證實了這一系統(tǒng)可以通過系統(tǒng)給藥來完成對siRNA表達質(zhì)粒的遞送。為了觀察我們所設(shè)計的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒對Pokemon基因的沉默作用，我們用不同的電荷比所制備的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒包括2種靶向腫瘤的模擬病毒(K18+RGD，K18+Linker+RGD)以及單純多聚賴氨酸(K18)所制備的非靶向的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒，在體外分別感染Hela細胞，并通過Q-PCR檢測了Hela細胞被感染后，其Pokemon基因的表達水平。作為對照，我們還觀察

14、了用滴度為105CFU/ml感染的Hela細胞以及把200ngsiRNA表達質(zhì)粒用轉(zhuǎn)染試劑直接轉(zhuǎn)染Hela細胞后，Pokemon基因的表達變化。凝膠阻滯實驗以及結(jié)果顯示，當電荷比達到2以上時，質(zhì)粒所帶的負電荷被完全中和，同時透射電鏡觀察也顯示只有當電荷比達到2以上時，多肽包裝系統(tǒng)才能與質(zhì)粒自組裝形成完整的病毒樣顆粒。DNaseⅠ保護性實驗也證實了，只有在此電荷比以上時，多肽包裝系統(tǒng)才能對質(zhì)粒起到完全的保護作用。Q-PCR檢測結(jié)果顯示，K

15、18+RGD，K18+Linker+RGD及K18對照組模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒的沉默效應無顯著差異，均在電荷比為4時的沉默效應最強，在此比例下感染Hela細胞，其Pokemorl基因的表達均相當與正常Hela細胞下降了43％，而逆轉(zhuǎn)錄病毒感染組下降了約50％左右。 (四)模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒抗腫瘤效應的在體研究最后，為觀察靶向腫瘤的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒在活體內(nèi)的作用，我們在SCID小鼠的腹股溝區(qū)皮下接種1×107個Hela細胞建立了移殖瘤模型，進行

16、了預防性實驗和治療性實驗。在預防性實驗中，我們在接種Hela細胞的同時，就通過小鼠尾靜脈注射了相當于4pmol重組siRNA表達質(zhì)粒的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒，此后每5天注射一次，并觀察我們所制備的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒預防腫瘤生成的作用。在治療性實驗中，則將首次注射時間改在接種后12d，腫瘤直徑為5mm左右時。預防性實驗結(jié)果顯示，接種Hela細胞3周后，注射靶向腫瘤的2種模擬病毒的10只小鼠均無腫瘤生成，在K18對照組也僅有2只小鼠生成腫瘤，而空白對照

17、組及空載對照組的各5只小鼠均在12d左右就有可觸及的腫瘤生成。在治療性實驗中，經(jīng)過4次注射后，在K18+RGD，K18+Linker+RGD實驗組以及K18對照組中，腫瘤生長均明顯受到抑制，腫瘤體積明顯小于空白對照及空載對照組。在這些實驗組中，K18+Linker+RGD組的效果最好。 綜上所述，本研究構(gòu)建了針對Pokemon癌基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒siRNA表達質(zhì)粒，并且證實了通過下調(diào)Pokemon基因的在腫瘤細胞內(nèi)的表達，可以