針對PTN重組慢病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù)在小細胞肺癌基因治療中的實驗研究.pdf

1、目的：構(gòu)建針對多效蛋白（pleiotrophin，PTN）基因的小干涉RNA（siRNA）慢病毒表達載體并觀察其對人小細胞肺癌H446細胞株P(guān)TN表達抑制及對細胞生長及凋亡的影響。同時觀察PTN基因沉默后，人小細胞肺癌H446細胞中與血管新生、腫瘤生長、侵襲過程相關(guān)的血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）、angiomotin（Amot）、schlafen5（Slfn5）和金屬蛋白酶9（MMP-9）4種基因的表達變化。構(gòu)建人小細胞肺癌H446

2、細胞裸鼠異種移植瘤模型，觀察PTN基因RNA干擾病毒對移植瘤瘤體生長的抑制作用。
　　 方法：利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western blot方法檢測PTN在H446細胞中的表達。設(shè)計四對針對PTN基因的小發(fā)夾RNA（shRNA）序列，與Plvthm載體連接，構(gòu)建慢病毒表達載體LV（lentiviral）-shPTN，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細胞，陽性克隆測序鑒定。再用LV-shPTN與pRsv-REV、pM

3、Dlg-pRRE、pMD2G三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，小量包裝與純化產(chǎn)生慢病毒顆粒。病毒感染H446細胞后，用熒光定量PCR及Western blotting檢測細胞中PTN基因的表達。選擇對PTN基因干擾效率最高的候選慢病毒載體進行大量包裝、純化及病毒滴度測定。將獲得的病毒感染H446細胞，實驗分為正常未干擾細胞組、感染空對照病毒的陰性對照組、感染PTN基因RNA干擾病毒抑制組、化療組及感染PTN基因RNA干擾病毒抑制加化療組。采用

4、四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測細胞生長，流式細胞儀（FCM）分析細胞凋亡。RT-PCR檢測未干擾細胞組、陰性對照組、PTN抑制組和PTN抑制加化療組細胞中Amot、Slfn5、MMP-9和VEGF的表達。采用H446細胞直接皮下接種的方法構(gòu)建人小細胞肺癌H446細胞裸鼠異種移植瘤動物模型，分為正常未干擾組，化療（順鉑）組，干擾PTN的病毒組，化療+干擾PTN的病毒組和陰性病毒對照組。瘤體附近多點皮下注射病毒或順鉑后，分別于第1、2、

5、7、15天測量瘤體體積。并在治療第15天分別用RT-PCR和Western blot方法檢測正常未干擾組、陰性病毒對照組及干擾PTN的病毒組中PTN的表達。
　　 結(jié)果：RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果均表明，PTN基因在H446細胞中表達顯著高于H460細胞。構(gòu)建的慢病毒載體經(jīng)測序驗證正確。所構(gòu)建的shRNA序列（GCAGCTGTGGATACTGCTGAA）對PTN mRNA的抑制效率為72％，對PTN蛋白的抑制

6、效率為59.2％。大量包裝與純化后病毒滴度為1×108 TU/ml。PTN基因抑制組的H446細胞活力顯著低于正常未干擾組和陰性對照組細胞，基因抑制聯(lián)合化療組較單純基因抑制組及化療組細胞活力下降，細胞凋亡率增高，并具呈濃度依賴性。PTN基因沉默后，H446細胞中Slfn5和MMP-9的表達分別較陰性對照組上調(diào)了165.1％和47.3％，而Amot和VEGF的表達分別較陰性對照組下調(diào)了33.1％和26.6％。協(xié)同化療后，上述趨勢更為明顯。

7、動物實驗瘤體組織中干擾PTN病毒組PTN mRNA和PTN蛋白的表達明顯低于正常未干擾組及陰性病毒對照組，抑制率為分別為39％及28％。干擾PTN病毒組瘤體體積顯著小于正常未干擾組及陰性病毒對照組，若協(xié)同化療則瘤體縮小更明顯。
　　 結(jié)論：構(gòu)建PTN RNA干涉載體，轉(zhuǎn)染后可有效降低H446細胞PTN的轉(zhuǎn)錄和表達，抑制H446細胞的生長并促進其凋亡，并可進一步影響H446細胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達變化。動物實驗也顯示針對PTN