pIRES介導(dǎo)的CD、TK雙自殺基因構(gòu)建及其對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：腺樣囊性癌(adenoidcysticcarcinoma)又稱(chēng)圓柱瘤(cylindroma)，由Billroth首次報(bào)道，多數(shù)人認(rèn)為腫瘤來(lái)自涎腺導(dǎo)管，也可能來(lái)自口腔粘膜的基底細(xì)胞。腺樣囊性癌占涎腺腫瘤的5﹪～10﹪，在涎腺惡性腫瘤中占24﹪，其中在頜下腺及舌下腺中是居首位的惡性腫瘤，最多見(jiàn)的年齡是40～60歲。其主要的病理學(xué)特點(diǎn)為嗜神經(jīng)侵犯及易于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前對(duì)腺樣囊性癌多主張采用手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療為主，其五年生存率一般在6

2、0﹪左右，其10年、15年、20年生存率分別為30～39﹪、24～26﹪、12.5～21﹪，其療效仍然不能令人滿(mǎn)意。因此，探討新的治療方法具有極其重要的意義。 近年來(lái)腫瘤的基因治療發(fā)展迅速，主要的方法有自殺基因、免疫基因、多藥耐藥基因以及抗血管生成基因等。其中自殺基因被認(rèn)為是最有前景的基因治療方法之一。自殺基因治療(Suicidegenetherapy)又稱(chēng)酶/藥物體前體療法(enzyme-prodrugtherapy，EPT)

3、，是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將哺乳動(dòng)物中所不含有的自殺基因轉(zhuǎn)入到哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞中，該基因表達(dá)的產(chǎn)物可將無(wú)毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為毒性藥物，從而選擇性的殺傷腫瘤細(xì)胞，常用的自殺基因有單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase，HSV-TK)基因和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(E.coli-cytosinedeaminase，CD)基因，前者催化無(wú)毒性抗病毒核苷類(lèi)似物如丙氧鳥(niǎo)苷(GCV)、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷(ACV

4、)等成為單磷酸核苷衍生物(dTMP)，然后在內(nèi)源性細(xì)胞激酶作用下轉(zhuǎn)化為有明顯毒性的三磷酸核苷(dTTP)，作為DNA合成鏈的終止劑，干擾細(xì)胞DNA的合成[1,2.20]；后者編碼的胞嘧啶脫氨酶可催化5-氟胞嘧啶(5-FC)脫氨為5-氟尿嘧啶(5-FU)，然后代謝為有毒性的5-氟尿嘧啶-5'三磷酸(5-FUTP)和5-氟-2'脫氧尿嘧啶-5'三磷酸(5-FdUTP)，5-FUTP通過(guò)與UTP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而抑制mRNA和tRNA的合成，5-F

5、dUTP則作用于胸苷合成酶(TS)，導(dǎo)致TMP的衰竭而阻止DNA的合成，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[3,4,19]。已有的研究證實(shí)聯(lián)合基因治療具有單自殺基因無(wú)可比擬的優(yōu)越性，越來(lái)越受人們關(guān)注。 本研究旨在構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-CD及pIRES-TK，并共同轉(zhuǎn)染ACC-2細(xì)胞，并應(yīng)用前體藥物治療，探討其對(duì)ACC-2細(xì)胞的殺傷作用及旁觀(guān)者效應(yīng)，以尋求有效的自殺基因治療方法。 方法首先根據(jù)CD、TK的DNA序列分別設(shè)計(jì)、合成

6、引物，并將擴(kuò)增后產(chǎn)物分別插入克隆載體pMD18-T中，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-CD及pMD18-T-TK，并進(jìn)行PCR篩選及重組質(zhì)粒的酶切分析，然后插入經(jīng)相應(yīng)酶切的真核表達(dá)載體pIRES，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-CD及pIRES-TK，并進(jìn)行菌落PCR初步鑒定及重組質(zhì)粒的酶切分析。然后以電穿孔方法將重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-CD及pIRES-TK轉(zhuǎn)染ACC-2細(xì)胞，新霉素(GeneticinG418)篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)的ACC-2

7、/CD-TK細(xì)胞，并經(jīng)RT-PCR鑒定CD、TK是否整合到ACC-2細(xì)胞DNA鏈中并轉(zhuǎn)錄表達(dá)。分組進(jìn)行前體藥物(GCV/5-FC)治療，加入不同濃度的GCV及5-FC對(duì)ACC-2/CD-TK細(xì)胞和ACC-2細(xì)胞進(jìn)行處理，并以未加藥組作對(duì)照，MTT法檢測(cè)藥物的殺傷效果及其對(duì)ACC-2細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖的影響，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(GIR)及半數(shù)抑制濃度(IC50)；并觀(guān)察ACC-2/CD-TK與ACC-2細(xì)胞在不同混育比例、不同混育時(shí)間下應(yīng)用

8、同一濃度的GCV及5-FC對(duì)腺樣囊性癌的殺傷作用；并用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期比例的變化及細(xì)胞凋亡的情況；同時(shí)觀(guān)察ACC-2/CD-TK細(xì)胞和ACC-2細(xì)胞在不同混育比例下GCV、5-FC單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用所產(chǎn)生的旁觀(guān)者效應(yīng)(即殺傷轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，通過(guò)擴(kuò)散作用殺傷臨近未轉(zhuǎn)染自殺基因的腫瘤細(xì)胞)。 結(jié)果成功克隆了大腸桿菌CD基因和HSV-TK基因，并進(jìn)行了DNA序列分析，和基因庫(kù)報(bào)道的基因序列基本一致，然后將克隆的CD基因

9、和HSV-TK基因分別插入克隆載體pMD18-T，后將重組的克隆載體pMD18-T-CD、pMD18-T-TK和pIRES分別經(jīng)雙酶切，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-CD及pIRES-TK，并分別進(jìn)行了菌落分析和酶切鑒定。將重組質(zhì)粒pIRES-CD及pIRES-TK成功轉(zhuǎn)入ACC-2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)CD、TK基因的ACC-2/CD-TK細(xì)胞，RT-PCR顯示長(zhǎng)度為228bp及361bp的陽(yáng)性條帶，證實(shí)目的基因已整合

10、到ACC-2細(xì)胞染色體DNA鏈中并轉(zhuǎn)錄表達(dá)，目的基因轉(zhuǎn)染對(duì)ACC-2細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)特性影響不大。 GCV對(duì)ACC-2/CD-TK細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用，而且具有劑量依賴(lài)性效應(yīng)，當(dāng)GCV濃度大于10-2ug/ml時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)對(duì)ACC-2/CD-TK細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制；而在細(xì)胞濃度為102ug/ml時(shí)幾乎未見(jiàn)該細(xì)胞生長(zhǎng)。根據(jù)量效關(guān)系計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.11ug/ml，而未轉(zhuǎn)染ACC-2細(xì)胞的生長(zhǎng)僅在GCV濃度達(dá)到102

11、ug/m1時(shí)才開(kāi)始出現(xiàn)受到抑制，而且作用輕微，其IC50為225.5ug/ml，約為轉(zhuǎn)染后細(xì)胞IC50值的70倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析二者差異有顯著意義(P＜0.01)；5-FC濃度為20ug/ml時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)對(duì)ACC-2/CD-TK細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制；而在細(xì)胞濃度為320ug/ml時(shí)幾乎未見(jiàn)該細(xì)胞生長(zhǎng)，根據(jù)量效關(guān)系計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)為55.42ug/ml，而未轉(zhuǎn)染ACC-2細(xì)胞的生長(zhǎng)僅在5-FC濃度達(dá)到160ug/ml時(shí)才開(kāi)始出現(xiàn)受到抑制

12、，而且作用輕微，其IC50為265.56ug/ml，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析二者差異有顯著意義(P＜0.01)。而聯(lián)合應(yīng)用5-FC+GCV，其對(duì)應(yīng)濃度下對(duì)細(xì)胞的殺傷效果明顯超過(guò)了單一應(yīng)用GCV和5-FC。 不同混育比例和時(shí)間的細(xì)胞殺傷作用結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)GCV和5-FC的敏感性與混育比例的大小、混育時(shí)間有關(guān)。隨著ACC-2/CD-TK細(xì)胞比例的增大，其殺傷作用越明顯；同時(shí)，混育時(shí)間越長(zhǎng)，其殺傷作用越明顯，說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染及基因的表達(dá)均

13、需要一定的時(shí)間，混育時(shí)間太短會(huì)影響其轉(zhuǎn)染的效果，進(jìn)而影響其殺傷作用。 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示GCV及5-FC作用后，ACC-2/CD-TK細(xì)胞周期中DNA合成期(S期)比例升高，DNA合成前期及靜止期(G0/G1期)、DNA合成后期及分裂期(G2/M期)比例相應(yīng)減少，細(xì)胞碎片增多，并出現(xiàn)明顯的Gl期前亞二倍體峰(即凋亡峰)：ACC-2細(xì)胞加藥后未見(jiàn)有明顯改變。 單一應(yīng)用GCV時(shí)，當(dāng)混合細(xì)胞中轉(zhuǎn)染細(xì)胞比例小于30﹪時(shí)，該效應(yīng)并

14、不明顯，而比例超過(guò)30﹪時(shí)方出現(xiàn)明顯的旁觀(guān)者效應(yīng)，隨著ACC-2/CD-TK細(xì)胞混育比例的增加，其效應(yīng)逐漸加強(qiáng)，混育比例大于50﹪時(shí)才出現(xiàn)明顯的旁觀(guān)者效應(yīng)；應(yīng)用5-FC，混合細(xì)胞中轉(zhuǎn)染細(xì)胞比例為5﹪時(shí)即出現(xiàn)旁觀(guān)者效應(yīng)，當(dāng)混育比例超過(guò)50﹪后各組的細(xì)胞殺傷效果已無(wú)顯著差異(P＞0.05)；聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，在不同的混育細(xì)胞比例下均出現(xiàn)藥物協(xié)同作用，旁觀(guān)者效應(yīng)明顯增加，當(dāng)混合細(xì)胞中ACC-2/CD-TK細(xì)胞比例為10﹪時(shí)甚至出現(xiàn)顯著協(xié)同作用，當(dāng)混

15、育比例大于30﹪后各組的細(xì)胞殺傷效果己無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 結(jié)論1.成功克隆了大腸桿菌CD基因，并構(gòu)建了克隆載體pMD18-T-CD，并對(duì)CD基因進(jìn)行序列分析顯示，克隆的序列和文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致。 2.在克隆載體pMD18-T-CD的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pIRES-CD，并進(jìn)行了菌落分析和酶切鑒定。 3.成功克隆了HSV-TK基因，并構(gòu)建了克隆載體pMD48-T-TK，并對(duì)TK基因進(jìn)行序列分析

16、顯示，克隆的序列和文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致。 4.在克隆載體pMD18-T-TK的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pIRES-TK，并進(jìn)行了菌落分析和酶切鑒定。 5.應(yīng)用電穿孔的方法成功將pIRES-CD、pIRES-TK轉(zhuǎn)染ACC-2細(xì)胞，并進(jìn)行RT-PCR鑒定，獲得了預(yù)期的228bp和361bp的片段，表明了目的基因CD和TK己整合到ACC-2細(xì)胞染色體DNA鏈中，并進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。 6.應(yīng)用CD-TK融合基

17、因治療時(shí)，HSV-TK/GCV體系對(duì)ACC-2/CD-TK細(xì)胞有明顯的劑量依賴(lài)性效應(yīng)，但旁觀(guān)者效應(yīng)并不突出；CD/5-FC體系也可產(chǎn)生劑量依賴(lài)性效應(yīng)，但有明顯的旁觀(guān)者效應(yīng)，從而彌補(bǔ)了HSV-TK/GCV體系的不足，明顯提高了CD-TK融合自殺基因的療效及應(yīng)用價(jià)值。而且隨著ACC-2/CD-TK細(xì)胞比例的增大，其殺傷作用越明顯；同時(shí)，混育時(shí)間越長(zhǎng)，其殺傷作用越明顯。 7.流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，應(yīng)用CD-TK融合基因治療后，ACC-2