產(chǎn)紫杉醇真菌NK-36b的分離鑒定及高效DNA轉(zhuǎn)化方法建立.pdf

1、從柏樹枝中分離到一株內(nèi)共生真菌NK-36b，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過TLC法初步鑒定，與紫杉醇標準品具有相同的遷移率(Rf值)；經(jīng)HPLC定性定量檢測，與紫杉醇標準品具有相同的保留時間；經(jīng)質(zhì)譜進一步確定，與紫杉醇標準品具有相同的分子量；紫杉醇單克隆抗體實驗呈陽性反應。
　　 對NK-36b進行形態(tài)學鑒定，后根據(jù)真菌18S rDNA通用引物，以此菌的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增后的產(chǎn)物為1770 bp，測序結(jié)果初步鑒定到屬；PCR

2、擴增出該菌的rDNA基因間隔區(qū)ITS，該菌ITS序列長579 bp，測序結(jié)果進一步鑒定該菌株到種。
　　 繪制NK-36b的生長曲線及紫杉醇生產(chǎn)曲線。在200 rpm，28℃條件下，PDA液體培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)6 d該菌生長最旺盛，菌絲產(chǎn)量最高；3 d就開始產(chǎn)生紫杉醇，10 d產(chǎn)量最高，平均產(chǎn)量是1 mg/L培養(yǎng)基。
　　 為了便于在NK－36b中進行基因操作，建立了該菌的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tume

3、faciens)介導的高效轉(zhuǎn)化體系及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系。優(yōu)化了原生質(zhì)體實驗條件及步驟，采用8 mg/ml蝸牛酶，1 mg/ml纖維素酶，以0.7 MNaCl為消化緩沖液，35℃靜置消化1.5 h，紗布過濾，可得到106～108/ml的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體與質(zhì)粒DNA冰上共浴30 min，以60％的PEG3350介導轉(zhuǎn)化，得到的轉(zhuǎn)化子最多。繼代培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子確定轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果表明插入標記基因在無選擇壓力條件下培養(yǎng)8代仍穩(wěn)定。