表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型人工晶狀體研制及其抑制后發(fā)性白內(nèi)障的研究.pdf

1、第一部分：表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型人工晶狀體研制及其理化性質(zhì)和分子生物學(xué)指標檢測
　　 目的：
　　 評價應(yīng)用靜電層層自組裝技術(shù)在疏水性丙烯酸酯人工晶狀體(IOL)表面構(gòu)建TGF-β2抗體多層膜的可行性，并檢測表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型IOL的理化性質(zhì)和分子生物學(xué)指標。
　　 方法：
　　 首先應(yīng)用大氣壓下輝光放電等離子體預(yù)處理疏水性丙烯酸酯IOL，使其表面帶上足量負電荷。然后應(yīng)

2、用靜電層層自組裝技術(shù)在IOL表面逐層沉積聚乙烯亞胺(PEI)、TGF-β2抗體(anti-TGF-β2)和聚賴氨酸(PLL)，從而在IOL表面構(gòu)建PEI-(anti-TGF-β2/PLL)4-(anti-TGF-β2)多層膜。以石英晶體微天平(QCM)模擬并實時監(jiān)測靜電層層自組裝過程，了解自組裝膜的增長方式，自組裝膜中每層沉積的TGF-β2抗體的平均質(zhì)量、厚度和密度，以及自組裝膜中TGF-β2抗體的免疫活性。以靜態(tài)水接觸角(WCA)檢測

3、新型IOL的親水性。以X-射線光電子能譜分析(XPS)檢測新型IOL表面化學(xué)元素組成變化。以場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)和原子力顯微鏡(AFM)觀察新型IOL的表面形態(tài)變化。應(yīng)用SFDA關(guān)于IOL質(zhì)量檢測國家標準(YY-0290)對新型IOL進行光焦度、像質(zhì)、光譜透過率和動態(tài)疲勞耐久性測試，以觀察新型IOL的光學(xué)和力學(xué)特性有無改變。應(yīng)用免疫熒光和激光掃描共焦顯微鏡觀察新型IOL表面自組裝膜的穩(wěn)定性，以及自組裝膜中TGF-β2抗體的

4、免疫活性。
　　 結(jié)果：
　　 應(yīng)用QCM模擬靜電層層自組裝過程，發(fā)現(xiàn)PEI、TGF-β2抗體和PLL可以線性增長的方式逐層沉積在IOL表面，自組裝膜中每層沉積的TGF-β2抗體的平均質(zhì)量、厚度和密度分別為(77.45±8.00)ng，(1.42±0.15)nm和(0.48±0.05)μg/cm2。QCM檢查同時發(fā)現(xiàn)自組裝膜中的TGF-β2抗體可以0.82:1的比例結(jié)合人重組TGF-β2因子，提示自組裝膜中TGF-β2抗

5、體保持良好的免疫活性，而且主要以側(cè)面向上的方式分布。新型IOL的WCA為73.2°，較未處理IOL的WCA為92.1°明顯降低，提示新型IOL的親水性明顯改善。XPS檢查發(fā)現(xiàn)新型IOL表面化學(xué)成分中氧和氮元素含量明顯升高，進一步證實TGF-β2抗體成功自組裝到IOL表面。AFM檢查發(fā)現(xiàn)新型IOL的表面粗糙度較未處理組IOL稍有增加，F(xiàn)ESEM檢查發(fā)現(xiàn)新型IOL表面形態(tài)光滑、平整，與未處理組IOL無差別。新型IOL的光焦度、像質(zhì)、光譜透過

6、率和動態(tài)疲勞耐久性測試均符合國家標準。免疫熒光和激光掃描共焦顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)TGF-β2抗體多層膜可在新型IOL表面持續(xù)穩(wěn)定存在至少3個月，自組裝膜中TGF-β2抗體可以與外加TGF-β2因子結(jié)合，形成均勻、密集分布的免疫熒光沉積顆粒，提示自組裝膜中TGF-β2抗體保持良好的免疫活性。
　　 結(jié)論：
　　 本研究應(yīng)用大氣壓下輝光放電等離子體和靜電層層自組裝技術(shù)首次在IOL表面成功構(gòu)建了TGF-β2抗體多層膜，TGF-β2抗

7、體多層膜可以在IOL表面長期穩(wěn)定存在，并保持良好的抗體免疫活性，而且對IOL表面形態(tài)、光學(xué)和力學(xué)特性無明顯影響。
　　 第二部分：表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型人工晶狀體抑制后發(fā)性白內(nèi)障的研究
　　 目的：
　　 評價表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型IOL在體外和活體兔眼內(nèi)預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障的有效性和安全性。
　　 方法：
　　 將人晶狀體上皮細胞(LECs)接種到表面自組裝TGF-β

8、2抗體多層膜的新型IOL和未處理IOL的后表面，LECs接種后6h、24h和48h，分別應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察LECs在實驗組和對照組IOL表面的粘附和增殖情況。應(yīng)用劃痕實驗觀察并比較新型IOL和未處理IOL表面LECs在10ng/mlTGF-β2因子作用下的遷移情況。以α-SMA作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化標記蛋白，應(yīng)用免疫熒光顯微鏡觀察新型IOL和未處理IOL表面LECs在10ng/mlTGF-β2因子作用下的轉(zhuǎn)分化情況。在活體兔眼內(nèi)行晶狀

9、體超聲乳化吸除并植入新型IOL(實驗組)或未處理IOL(對照組)，制備兔眼后發(fā)性白內(nèi)障模型，在術(shù)后1d、3d、1w、1mon、3mon，應(yīng)用裂隙燈顯微鏡觀察實驗組和對照組兔眼前房閃輝、前方細胞和虹膜后粘連程度等前房炎癥反應(yīng)情況，并按照相應(yīng)評價標準進行評分；術(shù)后1mon和3mon應(yīng)用裂隙燈后照法拍攝后囊膜照片，以自行設(shè)計的PCO評價軟件測量并比較實驗組和對照組兔眼的后囊膜渾濁(PCO)嚴重程度。術(shù)后3mon處死兔，以Miyake-Appl

10、e后照法拍照進行PCO評分。摘取兔術(shù)眼眼球，取出IOL，應(yīng)用免疫熒光聯(lián)合激光掃描共焦顯微鏡檢查了解新型IOL表面TGF-β2抗體多層膜的完整性。將晶狀體囊膜以石蠟包埋切片后行HE染色，觀察囊膜表面LEcs增殖和細胞外基質(zhì)沉積情況；同時應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ在囊膜表面的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型IOL可以短暫(細胞接種后6h內(nèi))抑

11、制LECs的粘附，但最終對LECs的粘附和增殖無明顯影響。劃痕實驗發(fā)現(xiàn)LECs在新型IOL表面的遷移能力較在未處理IOL表面明顯下降。免疫熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)新型IOL表面LECs可以保持上皮細胞形態(tài)，而且α-SMA表達很少；而未處理IOL表面LECs呈纖維細胞形態(tài)，而且大量表達α-SMA。直接免疫熒光聯(lián)合激光掃描共焦顯微鏡檢查顯示，IOL表面的TGF-β2抗體多層膜在活體兔眼內(nèi)可以較長時間穩(wěn)定存在。兔眼后發(fā)性白內(nèi)障模型研究發(fā)現(xiàn)，除術(shù)后1

12、w和1mon時實驗組的前房閃輝和前房細胞較對照組有所減輕外，兩組之間的術(shù)后前房炎癥反應(yīng)無明顯差別。裂隙燈后照法與Miyake-Apple后照法PCO評分均顯示對照組后囊膜PCO評分顯著高于實驗組。HE染色顯示實驗組囊膜較薄，表面LECs數(shù)量較對照組明顯為少。免疫組織化學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)實驗組囊膜表面α-SMA和CollagenⅠ表達量較對照組明顯為少。
　　 結(jié)論：
　　 表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型IOL可以顯著抑制