低剪切力介導內皮細胞表達膜型基質金屬蛋白酶1的機制及辛伐他汀干預的研究.pdf

1、背景: 動脈粥樣硬化致病機理一直是心血管領域的研究熱點，先后有血栓形成學說、炎癥學說、脂質浸潤學說、單克隆學說、損傷反應學說、氧化學說、同型半胱氨酸學說以及精氨酸學說。Pober和Cotran在大量血流動力學與動脈粥樣硬化關系的研究成果基礎上，提出了動脈粥樣硬化發(fā)病學的剪切力學說（shear stress hypothesis），認為血流剪切力異常是促使動脈粥樣硬化病變形成的重要原因之一。 根據血管內皮細胞精細調節(jié)多種“

2、血管保護”效應分子的反應能力和流體機械力調節(jié)內皮細胞基因表達的潛能，剪切力學說認為，均勻的層流剪切力可選擇性地誘導內皮“動脈粥樣硬化保護性基因”的表達，從而作用于局部以抵消全身性危險因素的有害作用。血流動力學因素異常出現層流剪切力不均勻，內皮細胞分泌抗動脈粥樣硬化分子減少，高膽固醇血癥、高半胱氨酸血癥等危險因素的持續(xù)作用可促使動脈粥樣硬化病變的發(fā)生。顯然，動脈粥樣硬化灶性分布特點主要由血流動力學因素介導的血管易損性程度所決定。該定位分布

3、特點在人體和實驗動物均已得到證實，這有力地說明剪切力與動脈粥樣硬化病變發(fā)生部位的緊密關系。研究表明人的動脈管壁處于生理剪切力區(qū)域（剪切力≥l2dyne/c㎡）有抑制動脈粥樣硬化形成的保護性作用，而低剪切力區(qū)域（剪切力≤4dyne/c㎡）有促動脈粥樣硬化形成作用。 膜型基質金屬蛋白酶1（membrane type-1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP，MMP-14）是唯一錨定于細胞膜上的膠原蛋白酶，

4、其底物廣泛包括：膠原，纖連蛋白，層連蛋白，彈性蛋白，纖溶酶原等。實驗表明MT1-MMP可以通過促進單核細胞遷移、降解細胞外基質包括膠原等，促進易損斑塊的發(fā)生和發(fā)展。新近實驗通過選擇性基因敲除和過表達兩個方面證實，MT1-MMP通過影響斑塊膠原纖維含量在易損斑塊的形成過程中起到重要作用。 已有實驗證實，低剪切力可以上調MMP-2和MMP-9的表達，同時增加其活性，MT1-MMP可以通過活化MMP-2和MMP-9前膠原形式增加其活性

5、。然而，低剪切力與MT1-MMP的關系尚未明了。因此我們提出了這樣的假設：低剪切力可誘導MT1-MMP的表達，從而參與動脈粥樣硬化斑塊的形成。 研究目的： 1.在低剪切力動物模型中，觀察低剪切力對MT1-MMP的作用。 2.在體外細胞研究中，明確低剪切力與MT1-MMP的關系。 研究方法: 1.動物模型 20只8～10周齡雄性ApoE-/-小鼠，均給予高脂飲食（含0.25％膽固醇和15％脂

6、肪）喂養(yǎng)。通過縮窄性頸總動脈套管建立ApoE-/-小鼠左側頸總動脈低剪切力動脈粥樣硬化斑塊模型，右側頸總動脈假手術對照。 2.顯微超聲測量 應用顯微超聲技術測量小鼠左側和右側頸總動脈最大內膜中層厚度（IMT），收縮期內徑（Ds），近心端最大血流速度（Vmax）。根據公式τ（N/㎡）=4·Vmax·η/Ds，η是血液粘滯系數（采用η=0.035）計算小鼠左右兩側頸總動脈剪切力（τ）。 3.病理學檢測 8周末

7、應用過量戊巴比妥鈉注射使小鼠安樂死后，PBS液體灌洗血管，繼之灌注4％的多聚甲醛固定液。分離左側頸總動脈和右側頸總動脈，取材后標本置于4％的多聚甲醛固定液中浸泡固定12小時，OCT包埋，制作5um冰凍切片，標本每間隔50 um即連續(xù)切片20張，蘇木素-伊紅染色。其它相鄰切片做免疫組化檢測MT1-MMP的分布和含量。 4.體外人臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)及鑒定 4.1人臍靜脈內皮細胞的原代培養(yǎng)與傳代 無菌獲取剖宮產新生兒臍

8、帶15-20cm，沖洗臍靜脈管腔。將臍帶另一端用止血鉗夾閉，注入胰酶于超凈臺上室溫消化5-7 min。將胰酶抽出，置于離心管內，再沖洗管腔，洗出液置于離心管內，加入胎牛血清終止消化。離心10min，于超凈臺上將離心管內的上清液倒掉，以全培養(yǎng)基將細胞重新懸浮，轉移至培養(yǎng)瓶內，置于孵箱中培養(yǎng)，12-24h后換液，清除未貼壁細胞。 4.2傳代 待原代細胞融合成單層后，用PBS將細胞洗兩遍，以去除血清，加入0.25％胰酶2 ml

9、，孵箱內消化3-5min，在倒置相差顯微鏡下觀察見細胞變成圓形，吸出胰酶，加入培養(yǎng)基，輕輕吹打，待細胞全部懸浮，按105個/ml分裝，放回37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 4.3內皮細胞鑒定 免疫熒光法檢測CD31、CD34和Ⅷ因子：HUVECs接種于預先置于細胞培養(yǎng)板內的蓋玻片上，至細胞長成單層，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入95％乙醇固定30min，PBS沖洗，采用免疫熒光染色，滴加相應抗體血清，再滴加1：40熒光素標記的羊抗兔

10、疫熒光抗體，設陰性及空白對照。熒光顯微鏡下觀察、拍片。 5.內皮細胞剪切力干預分組 5.1不同作用時間下，低剪切力對臍靜脈內皮細胞表達MT1-MMP mRNA及蛋白質活性的影響 1）靜態(tài)對照組：不給予剪切力，細胞在靜態(tài)下培養(yǎng)。 2）低剪切力1小時組：給予低剪切力（4 dyne/c㎡）作用1小時，以觀察MT1-MMP mRNA及蛋白質活性的變化。 3）低剪切力3小時組：給予低剪切力（4 dyne/c

11、㎡）作用3小時，以觀察MT1-MMP mRNA及蛋白質活性的變化。 4）低剪切力5小時組：給予低剪切力（4 dyne/c㎡）作用5小時，以觀察MT1-MMP mRNA及蛋白質活性的變化。 5.2相同作用時間下，不同剪切力對臍靜脈內皮細胞表達MT1-MMP mRNA及其蛋白質活性的影響 1）靜態(tài)對照組：細胞不給予任何剪切力。 2）低剪切力組：給予低剪切力（4 dyne/c㎡2）分別作用1、3、5小時，觀察低

12、剪切力對MT1-MMP mRNA及蛋白質活性的影響。 3）生理剪切力組：給予生理性剪切力（12 dyne/c㎡）分別作用1、3、5小時，觀察低剪切力對MT1-MMP mRNA及蛋白質活性的影響。 6.實時定量RT-PCR 根據試劑盒說明，以Trizol自HUVECs中提取總RNA。用M-MLV試劑盒進行逆轉錄。于Light Cycler上實行實時定量PCR。每個樣本重復三次測量。MT1-MMP擴增引物：上游5'-

13、ACGTGCAGCAGCATTGGA-3'，下游5'-CAACAGGAGCAAGTGTGCCTTC-3'；β-actin擴增引物，上游5'-TGGACATCCGCAAAGAC-3'，下游5'-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3'。反應結束得到循環(huán)閾值（Ct值），用相對定量的方法（2-△△Ct）來分析數據。MT1-MMP mRNA表達以管家基因β-actin進行標化。 7.Western Blot分析 收集細胞后

14、，提取總蛋白，煮沸5分鐘。以SDS-PAGE電泳，然后轉膜，封閉，洗膜三次。以適當濃度的一抗4℃過夜后，洗膜。二抗孵育、洗膜，最后采用增強化學發(fā)光法觀察結果。 8.MT1-MMP活性測定 收集細胞后，加入適量蛋白提取液，收集上清液待查。吸取待測蛋白以及蛋白標準品加入96孔板中，輕輕搖晃20s，4℃孵育過夜。洗板4次，每孔滴加結合液50ul，混勻，滴加50ul反應試劑，搖晃20s混勻，在405nm讀取t0值。37℃孵育2.

15、5h，搖晃20s，405nm讀取t值。由標準品濃度根據濃度和（t-t0）×1000/6.25呈線性關系描繪標準曲線，由標準曲線得出待測值。 9.統計分析 實驗結果以均數±標準誤表示。應用SPSS13.0軟件進行分析，兩兩比較采用t檢驗，多組之間采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。 結論： 1.在ApoE-/-小鼠低剪切力模型中，低剪切力可以上調MT1-MMP的表達。 2.在體外研