鉤端螺旋體溶血素促炎反應及其信號通路和溶解吞噬泡膜介導免疫逃逸的研究.pdf

1、第一部分:鉤端螺旋體溶血素基因原核表達系統(tǒng)的建立及功能的研究
　　 鉤端螺旋體病(Leptospirosis，簡稱鉤體病)是一種全球分布的、洪澇時重點監(jiān)控的自然疫源性傳染病，是我國重點防疫和監(jiān)控的主要傳染病之一。致病鉤體賴株基因組中存在眾多編碼溶血素的基因表明溶血素在鉤端螺旋體病中發(fā)揮重要作用，但溶血素在鉤體感染巨噬細胞后基因表達水平和分泌性尚未闡明。本研究中采用T-A克隆等分子生物學方法構(gòu)建鉤體溶血素基因sph1(LA1027

2、)、sph2(LA1029)、sph3(LA4004)、sph4(LA3050)、hlpa(LA1650)、hlyC(LA3937)、hlyX(LA0378)和tlyA(LA0327)的原核表達系統(tǒng)及Ni-NTA親和層析法提純各重組溶血素蛋白，分光光度法檢測重組溶血素蛋白對綿羊紅細胞的溶血活性，實時熒光定量PCR檢測鉤體賴株感染THP-1和J774A.1細胞后溶血素基因mRNA水平變化及Western-blot檢測感染這兩種細胞后溶血素

3、蛋白的分泌性.結(jié)果成功地構(gòu)建了8個高效表達目的重組蛋白的表達系統(tǒng)及重組蛋白具備不同程度的溶血活性，感染巨噬細胞后8個溶血素基因水平上調(diào)，其中以sph2和hlpA上調(diào)更為顯著，在兩種細胞中rSph1、rSph2、rSph3、rHlpA和rTlyA均能夠分泌到胞外。這為后續(xù)深入研究8個溶血素的致病機理奠定了良好的基礎。
　　 第二部分:鉤端螺旋體溶血素促炎反應及其信號通路的研究
　　 人感染致病性鉤端螺旋體后可引起嚴重的全身

4、性炎癥反應，但是鉤體病人血清中完整的炎癥因子譜未見報道。鉤體賴株基因組中存在眾多編碼溶血素的基因表明溶血素在鉤端螺旋體致病中發(fā)揮作用，但關(guān)于鉤端螺旋體溶血素能否誘導炎性細胞因子分泌及相關(guān)的信號通路研究未見報道。本研究中，采用炎性相關(guān)細胞因子抗體芯片技術(shù)檢測鉤體病人和感染鉤體后的小鼠血清中的完整炎性因子譜。與鉤體病人血清相比，感染的小鼠血清中細胞因子出現(xiàn)相對較低的水平，而IL-1β，IL-6和TNF-α三種促炎性細胞因子是鉤體病人和感染后

5、小鼠血清均升高的細胞因子。鉤端螺旋體重組鞘磷脂類溶血素蛋白(rSph1-rSph4)和非鞘磷脂類溶血素蛋白(rHlpA、rHlyC、rHlyX和rTlyA)均可誘導人和小鼠巨噬細胞分泌IL-1β，IL-6和TNF-α，但在小鼠巨噬細胞中水平相對較低。TLR2和TLR4受體封閉后，溶血素誘導人和小鼠巨噬細胞釋放IL-1β，IL-6和TNF-α的能力減弱，這一結(jié)論在TLR敲除小鼠的單核巨噬細胞中也得到驗證。胞內(nèi)信號通路NF-κB和JNK抑制

6、劑處理后，人和小鼠巨噬細胞在溶血素刺激下釋放上述三種細胞因子的能力減弱。本研究發(fā)現(xiàn)8個鉤端螺旋體重組溶血素蛋白能通過TLR2和TLR4受體介導的JNK和NF-κB途徑誘導人和小鼠巨噬細胞分泌炎性細胞因子。
　　 第三部分:鉤端螺旋體侵入單核-巨噬細胞方式及其吞噬泡形成差異性研究
　　 為了探討鉤端螺旋體(簡稱鉤體)侵入人或鼠單核-巨噬細胞方式及其吞噬泡形成差異性。本研究中采用透射電鏡觀察鉤體賴株侵入小鼠單核-巨噬樣細胞J

7、774A.1和佛波酯(PMA)激活的人單核細胞THP-1后吞噬泡形成情況。采用免疫熒光聯(lián)合激光共聚焦顯微鏡及熒光分光光度儀等方法，觀察細胞內(nèi)吞抑制劑單丹磺酰尸胺(MDC)、氧化酚砷(PAO)阻斷及網(wǎng)格蛋白抗體封閉前后，J774A.1細胞和THP-1細胞內(nèi)鉤體賴株數(shù)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)774A.1細胞內(nèi)鉤體存在于吞噬泡內(nèi)，THP-1細胞內(nèi)鉤體無吞噬泡膜包繞。MDC和PAO能以劑量依賴方式抑制J774A.1和THP-1細胞內(nèi)吞鉤體，其中10μ

8、mol/L以上MDC和1μmol/L以上PAO阻斷的J774A.1和THP-1細胞內(nèi)鉤體數(shù)量明顯少于未阻斷細胞(P<0.05)。網(wǎng)格蛋白抗體封閉后，J774A.1和THP-1細胞內(nèi)鉤體數(shù)量也明顯減少(P<0.05)。從上述結(jié)果中得出如下結(jié)論：鉤體以網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞途徑侵入人或鼠單核-巨噬細胞。人或鼠單核-巨噬細胞內(nèi)鉤體吞噬泡形成有明顯差異，這可能是人或鼠感染鉤體后發(fā)病情況不同的原因之一。
　　 第四部分:鉤端螺旋體溶血素溶解吞

9、噬泡膜介導免疫逃逸的研究
　　 鉤體病是由致病性鉤體引起的全世界流行的人獸共患病，但致病性鉤體感染人和家禽(或野生動物)的癥狀不同。鉤體在感染人和動物時迅速通過皮膚和粘膜進入血流，吞噬過程是最重要的天然免疫防護機制之一，因此單核細胞和巨噬細胞在清除侵入病原菌的吞噬功能對鉤體感染的天然免疫保護中起到關(guān)鍵作用。鉤體與人和小鼠巨噬細胞相互作用的結(jié)局不一樣，大多數(shù)進入小鼠原代與傳代細胞的鉤體局限在吞噬泡內(nèi)，而感染人原代與傳代巨噬細胞內(nèi)大

10、多數(shù)鉤體分布在細胞質(zhì)內(nèi)，且不被吞噬泡膜所包裹；含鉤體的小鼠吞噬細胞膜能夠與溶酶體融合而被殺滅，但人巨噬細胞內(nèi)鉤體反而有繁殖的跡象。
　　 新生的吞噬體缺乏將病原體或攝入物質(zhì)殺死降解的能力，從吞噬體產(chǎn)生到成為具有殺死并降解被吞噬物的吞噬溶酶體的過程稱為吞噬體的成熟。微生物的逃逸機制是通過寄生在巨噬細胞內(nèi)的吞噬體中的細菌，干擾內(nèi)體的發(fā)生和成熟，導致形成的吞噬體不能獲得溶酶體性質(zhì)。致病性鉤體感染人巨噬細胞后是如何逃逸宿主天然防疫系統(tǒng)而

11、在其內(nèi)存活和繁殖以及鉤體溶血素是否參與此干擾吞噬體成熟的過程，均未見報道。
　　 本研究中，我們通過透射電鏡對THP-1和J774A.1細胞中吞噬泡的形成及演變的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)THP-1和J774A.1細胞在內(nèi)吞開始均形成吞噬泡膜，THP-1中吞噬泡膜出現(xiàn)消失的過程，但J774A.1細胞中的吞噬泡膜沒有出現(xiàn)消失的過程。通過對THP-1和J774A.1細胞吞噬泡成熟過程中的表面標志分子進行免疫熒光及激光共聚焦觀察，結(jié)果顯示THP-