Scopadulciol在Ad-hTERT-HSV-TK-GCV系統(tǒng)對(duì)膀胱癌治療中增效作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膀胱癌是我國(guó)泌尿外科最常見的腫瘤之一，占全身惡性腫瘤發(fā)病率的第八位，其特點(diǎn)是術(shù)后復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。目前膀胱癌的治療以手術(shù)切除為主，放、化療為輔，但其療效并不確定，特別是對(duì)于大多數(shù)中晚期膀胱腫瘤，尤其伴有局部擴(kuò)散或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，目前的治療效果均不理想。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及基因工程的發(fā)展，腫瘤的分子生物學(xué)機(jī)制得到進(jìn)一步的闡明，腫瘤的基因治療技術(shù)也隨之迅速發(fā)展，為膀胱癌的治療提供了一種新的且具有希望的手段。腫瘤的基因治療是指

2、在基因水平上通過載體系統(tǒng)將治療基因?qū)肽[瘤及其相關(guān)組織并有效表達(dá)從而達(dá)到治療目的。
　　 本課題研究，在構(gòu)建出hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的攜帶自殺基因HSV-tk的重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk基礎(chǔ)上，通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將Scopadulciol（SDC）與Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)其選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的效果進(jìn)行評(píng)估，觀察SDC對(duì)Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系統(tǒng)腫瘤殺傷作用的增強(qiáng)效應(yīng)，

3、并對(duì)其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行初步探討。本實(shí)驗(yàn)共分三個(gè)部分。
　　 一、 hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的HSV-tk基因重組腺病毒載體的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建一種受hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的、腺病毒介導(dǎo)的自殺基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)Ad-hTERT-HSV/tk。
　　 方法：利用DNA重組技術(shù)，首先構(gòu)建一種攜帶hTERT啟動(dòng)子和HSV/tk基因的重組腺病毒質(zhì)粒，然后在293細(xì)胞包裝成攜帶受hTERT啟動(dòng)子調(diào)控HSV/tk基因表達(dá)的重組腺病毒ad

4、-hTERT-HSV/tk。同時(shí)構(gòu)建CMV啟動(dòng)子調(diào)控的、攜帶自殺基因HSV/tk的重組腺病毒Ad-CMV-HSV/tk以及攜帶報(bào)告基因EGFP的重組腺病毒Ad-CMV-EGFP和Ad-hTERT-EGFP作為對(duì)照。應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取腺病毒DNA，對(duì)該4種病毒進(jìn)行PCR鑒定。腺病毒的擴(kuò)增及純化采用293細(xì)胞及氯化銫純化常規(guī)方法，病毒滴度測(cè)定采用TCID50法。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了4

5、種重組腺病毒Ad-CMV-HSV/tk、Ad-hTERT-HSV/tk、Ad-CMV-EGFP和Ad-hTERT-EGFP，按需要在293細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增后以氯化銫密度梯度離心法進(jìn)行純化，TCID50法測(cè)得病毒滴度分別為4×1010pfu/ml，1×1011pfu/ml，1.2×1011pfu/ml和3.7×1010pfu/ml。
　　 二、Scopadulciol對(duì)Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系統(tǒng)殺傷253J細(xì)胞增效作用的

6、體外試驗(yàn)研究
　　 目的：將SDC與構(gòu)建的具有腫瘤特異性的重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用，通過體外實(shí)驗(yàn)觀察該系統(tǒng)對(duì)膀胱癌253J細(xì)胞的殺傷作用，深一步研究SDC對(duì)重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系統(tǒng)在殺傷膀胱癌細(xì)胞中的增效作用。
　　 方法：
　　 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：膀胱癌細(xì)胞253J培養(yǎng)取含10％新鮮胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基：人正常肺成纖維細(xì)胞株MRC-5取M

7、EM培養(yǎng)基；置5％CO2孵箱中，飽和濕度及37℃培養(yǎng)。
　　 （2）觀察SDC對(duì)Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系統(tǒng)體外殺傷膀胱癌細(xì)胞的增效作用：將253J以及MRC-5細(xì)胞分別接種于24孔板中，每孔3×104個(gè)細(xì)胞，將兩種細(xì)胞分為6組，即Ad-hTERT-HSV-tk+GCV+SDC組、Ad-hTERT-HSV-tk+GCV組、單純Ad-hTERT-HSV-tk組、GCV+SDC組、單純GCV組、單純SDC組，空白對(duì)照以

8、PBS替代。
　　 （3） SDC對(duì)不同配伍濃度的Ad-hTERT-HSV-tk和GCV對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的殺傷作用：將生長(zhǎng)良好的膀胱癌細(xì)胞253J以及正常的成纖維細(xì)胞MRC-5分別按1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板：培養(yǎng)24h后，按MOI=100加入Ad-hTERT-HSV-tk，每30min輕搖一次；24h后分別加入5％血清培養(yǎng)液含GCV（0、1、10、100、1000μmol/L），含SDC（0、0.04或0.1μmol），

9、37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)；每3d換一次上述培養(yǎng)液，6d后，四唑鹽比色試驗(yàn)法（MTT）測(cè)定細(xì)胞存活率，分別比較不同濃度的GCV、SDC殺傷效果的差異。
　　 （4）體外旁殺傷效應(yīng)觀察：將Ad-hTERT-HSV-tk按MOI=100轉(zhuǎn)染253J細(xì)胞；24h后將上述腫瘤細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染Ad-hTERT-HSV-tk的腫瘤細(xì)胞以不同比例混合培養(yǎng)，共分5組（0、30％、50％、70％、100％）；在5組253J腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入GCV

10、使其濃度為100μmol/L或濃度為100μmol/L的GCV聯(lián)合應(yīng)用SDC0.04μmol，空白對(duì)照組未按相同轉(zhuǎn)染比例混合后以PBS替代GCV和SDC，每種情況重復(fù)3孔；6d后分別進(jìn)行MTT測(cè)定細(xì)胞存活率，比較殺傷效果。
　　 結(jié)果：
　　 （1）重組腺病毒對(duì)253J和MRC-5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率
　　 倒置熒光顯微鏡下觀察顯示，加入重組腺病毒Ad-hTERT-EGFP，MRC-5細(xì)胞未見明顯熒光表達(dá)。而Ad-hT

11、ERT-EGFP對(duì)253J細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率隨重組腺病毒的MOI增高而增加，當(dāng)MOI為O時(shí)，無熒光表達(dá)；MOI為1時(shí)，僅少數(shù)細(xì)胞有熒光（7.5％）：MOI為10時(shí)，40.7％的253J細(xì)胞EGFP表達(dá)陽性；MOI=100時(shí)，88.3％的253J細(xì)胞EGFP表達(dá)陽性；MOI=1000時(shí)，所有細(xì)胞均出現(xiàn)熒光。提示Ad-hTERT-EGFP對(duì)兩細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率有明顯差異。
　　 （2） SDC對(duì)HSV-TK激酶作用的GCV在膀胱腫瘤基因治療中的

12、增效作用：Ad-hTERT-HSV-tk+GCV+SDC組253J細(xì)胞存活率明顯低于MRC-5細(xì)胞；Ad-hTERT-HSV-tk+GCV組253J細(xì)胞存活率亦低于MRC-5細(xì)胞；單純Ad-hTERT-HSV-tk組、GCV+SDC組、單純GCV組、單純SDC組，對(duì)兩種細(xì)胞株均無明顯的殺傷作用。
　　 （3）SDC對(duì)不同配伍濃度的Ad-hTERT-HSV-tk和GCV對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞體外旁殺傷效應(yīng)：結(jié)果顯示，GCV聯(lián)合應(yīng)用SDC后

13、，253J細(xì)胞的存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Ad-hTERT-HSV-tk+GCV對(duì)253J細(xì)胞的殺傷作用隨著GCV濃度的增加而逐漸增強(qiáng)的基礎(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用SDC后，對(duì)253J細(xì)胞的殺傷作用有明顯增強(qiáng)作用。
　　 （4）體外旁殺傷效應(yīng)的觀察：結(jié)果提示，丙氧鳥苷在殺死tk陽性253J細(xì)胞的同時(shí)，也可以殺死與其共同培養(yǎng)的tk陰性253J細(xì)胞，隨著tk陽性253J細(xì)胞比例的增加，混合細(xì)胞的存活數(shù)量明顯減少；其聯(lián)合應(yīng)用SDC后，

14、殺傷作用又有明顯增強(qiáng)。
　　 三、Scopadulciol對(duì)Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系統(tǒng)對(duì)膀胱癌治療中增效作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：將SDC與構(gòu)建的具有腫瘤特異性的重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察該系統(tǒng)對(duì)膀胱癌253J細(xì)胞的殺傷作用及抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，深一步研究SDC對(duì)重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系統(tǒng)在殺傷膀胱癌細(xì)胞中的增效作用。

15、>　　 方法：
　　 （1）裸鼠膀胱癌模型的建立及分組：將膀胱癌細(xì)胞用無菌生理鹽水配成1×107細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。在小鼠右前肢腋窩皮下注入0.2ml細(xì)胞懸液。觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)至直徑約為6mm和/或體積為100mm3時(shí)，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為4組，每組4只， A組為Ad-hTERT-HSV/tk+GCV+SDC組；B組為Ad-hTERT-HSV/tk+GCV組；C組為Ad-hTERT-HSV/tk+SDC組；D組

16、為對(duì)照組，裸鼠體內(nèi)每天僅注射PBS。
　　 （2） Ad-hTERT-HSV-tk/GCV/SDC治療腫瘤的療效觀察：腫瘤生長(zhǎng)抑制的觀察：自注射藥物開始，每7天用圓規(guī)和游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤的體積，描繪腫瘤的生長(zhǎng)曲線，共觀察6周。觀察結(jié)束后處死裸鼠，解剖觀察瘤體的大體形態(tài)，取對(duì)照組和治療組的腫瘤組織稱重。按（1-治療組重量/對(duì)照組重量）×100％計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。
　　 結(jié)果：Ad-hTERT-HSV-tk/G

17、CV/SDC對(duì)荷瘤裸鼠膀胱癌的生長(zhǎng)抑制的影響：BALB/C裸鼠皮下接種253J細(xì)胞2周后，可見所有的裸鼠均有腫瘤生長(zhǎng)，成瘤率為100％，腫瘤直徑約0.5cm-0.6cm。選用瘤體大小一致的裸鼠分組實(shí)驗(yàn)，可見C、D各組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)迅速，瘤的體積無顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 1、本研究成功構(gòu)建了分別由hTERT啟動(dòng)子和CMV啟動(dòng)子調(diào)控的攜帶HSV-tk基因和EGFP基因的重組腺病毒Ad-hTERT-HSV/tk、Ad-

18、CMV-HSV/tk、Ad-hTERT-EGFP和Ad-CMV-EGFP。對(duì)其進(jìn)行純化、擴(kuò)增后具有較高滴度。
　　 2、通過體外實(shí)驗(yàn)證明，聯(lián)合應(yīng)用GCV情況下，hTERT啟動(dòng)子控制下HSV-tk基因的表達(dá)能特異地殺傷膀胱癌細(xì)胞253J，在此基礎(chǔ)上，該系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用SDC后，Ad-hTERT-HSV/tk/GCV系統(tǒng)對(duì)膀胱癌細(xì)胞253J的殺傷作用又有了明顯的增強(qiáng)。
　　 3、通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，聯(lián)合應(yīng)用SDC后，Ad-hTER